范晓静，周鲁明，刘殿辰，赵博生

（山东理工大学 生命科学学院 发育与进化生物学实验室，山东 淄博 255049）

东亚三角涡虫Djtraf3基因的时空表达模式

范晓静，周鲁明，刘殿辰，赵博生

（山东理工大学 生命科学学院 发育与进化生物学实验室，山东 淄博 255049）

肿瘤坏死因子受体相关因子3（TRAF3）作为TRAF家族的成员之一，通过介导TLRs信号通路，参与动物的免疫反应。通过构建东亚三角涡虫Djtraf3的cDNA文库获得Djtraf3基因并分析基因结构。结果发现，该最大开放阅读框为564 bp，编码的蛋白质含187个氨基酸，含有1个TRAF结构域。进化分析表明，DjTRAF3和果蝇的TRAF3聚群，位于进化树的基部；整体原位杂交结果显示，在涡虫成体及不同再生阶段，Djtraf3在整个肠部表达。这些结果为进一步探究其功能提供了依据和方向。

东亚三角涡虫；Djtraf3；DIG-labeling RNA探针；原位杂交

肿瘤坏死因子受体相关因子（tumor necrosis factor receptor-associated factors，TRAFs）是介导生物体内细胞因子间信号传导的一类适配蛋白［1］，1994年12月，Hu等［2］通过酵母双杂交技术得到了一个含有高度保守的TRAF结构域和锌指结构的新蛋白，该蛋白可以通过与 CD40蛋白相互作用来促进下游信号通路的传导，将该蛋白命名为TRAF3，也叫CD40结合蛋白。TRAF3是TRAFs家族功能最为多样化的成员之一，TRAF3可以与 MyD88（myeloid differentiation factor 88）、TRIF（toll-receptorassociated activator of interferon）相互作用，促进TRAF3与IRAK-1（interleukin-1（IL-1）-receptorassociated kinase-1）、TBK-1（TRAF-associated NFKB activator binding kinase-1）和IKK-ε（IkB kinase-ε）蛋白复合物的形成，诱导IFN（type I interferon）的表达，介导TLRs信号通路，从而参与机体的免疫［3-4］；Oganesyan等［5］发现TRAF3在不依赖TLRs信号通路的抗病毒过程中也有重要作用。TRAF3蛋白还能通过自身指环结构的活性和TRAF结构域与NF-κB诱导激酶（NF-κB inducing kinase，NIK）的绑定结合来调控MAPK（mitogen-activated protein kinases），激活蛋白激酶的蛋白水平，从而调控pl00转变为p52的NF-κB活化过程，同时，TRAF3还可以通过抑制NF-κB的活性参与淋巴毒素β受体（LTβR）诱导细胞凋亡的过程［6-9］。此外，TRAF3还与EBV（epstein-barr virus）介导的疾病、套细胞淋巴癌和自身免疫疾病相关。目前，通过对Hodgkin疾病的研究，证明抑制TRAF3的降解，有助于对于该疾病的治疗［10］。迄今为止，已在线虫、果蝇、斑马鱼、鼠和人等多种生物体中发现了TRAF3的存在，在哺乳动物中，traf3基因广泛表达于体内的各个组织，例如心、脾、肺、肝脏和肠等［11］。

东亚三角涡虫（Dujesia japonica）属于扁形动物门（Platyhelminthes）、涡虫纲（Turbelaria）、三肠目（Tricladicla）、三角涡虫科（Dugesiidae）、真涡虫属（Dugesia），是扁形动物门涡虫纲的代表动物。扁形动物是在动物演化进程中是首次出现两侧对称、三胚层的类群［12-13］，且涡虫具有很强的再生能力，身体的每一小段都能再生成一个完整的个体，因而其已成为研究进化、发育和再生机制的模式动物［14-15］。

笔者通过DIG-labeling RNA探针和原位杂交技术来研究Djtraf3基因在涡虫成体和不同再生阶段的具体位置，为进一步研究其功能奠定基础，同时为探究该基因在不同物种中的生物学功能及进化历程提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

东亚三角涡虫采于山东省博山区泉河头，用大约20℃灭菌且用充氧过夜的凉开水饲养，每周用鸡蛋黄喂食涡虫1次，隔天换水，实验前涡虫饥饿处理1周。含东亚三角涡虫Djtraf3基因的重组质粒pcDNA 3.0-Djtraf3保存在由笔者所在实验室成员构建的涡虫cDNA文库中。Nde I、Sp6 RNA聚合酶、RNase Inhibitor、Dnase，Fermentas公司；Yeast Extract、甘氨酸（Gly）、蛋白酶 K，Amresco公司；DIG RNA labeling Mix、地高辛抗体、blocking reagent，Roche公司，其他药品为市售分析纯。

1.2 生物信息学分析

经初步分析的DjTRAF3氨基酸序列，在NCBI进行 Blastp比对，寻找保守区域（conservation domain，CD）和同源蛋白序列。用DNASTAR软件包中的MegAlign软件分析同源蛋白的CD序列之间的相似性；用 PHYLIP 3.5c软件包中的 Neighbor-Joining方法，采用bootstrap复制数为1 000，并用Cavia porcellus TRAF2作为外类群构建进化树。

1.3 DIG标记的RNA探针的合成

碱裂解法提取pcDNA3-Djtraf3质粒，NdeⅠ限制性内切酶酶切pcDNA3-Djtraf3质粒，以线性化的pcDNA3-Djtraf3质粒DNA为模板，用SP6 RNA聚合酶体外转录合成反义的DIG标记的RNA探针；对照利用T7 RNA聚合酶合成正义链的探针。

1.4 再生涡虫及成体涡虫的制备

选择大小适中的涡虫，将其切割成头、中、尾3部分，隔天换水，依次收集再生3、5、7和10 d的涡虫各15条，将再生涡虫与20条成体涡虫用2%（体积分数）的盐酸杀死，除去盐酸，加入4%（体积分数）的多聚甲醛于4℃固定4 h，用30%、50%和70%（体积分数）的乙醇依次脱水，每次1min，最后溶于70%的乙醇中，-20℃保存。

1.5 原位杂交

标本经6%（体积分数）H2O2漂白，20 μg/mL的Protease K消化25min，Gly终止后，用磷酸钠-吐温缓冲液（NaPBSTw）和磷酸钠缓冲液（NaPBS）洗涤，40g/L多聚甲醛固定1 h，0.1 mol/L三乙醇胺加0.25%（体积分数）乙酸酐进行乙酰化，56℃预杂交3 h，加入DIG标记的探针56℃杂交36 h，其中5条成体涡虫不加探针作为空白对照组。杂交后分别用柠檬酸钠缓冲液（saline sodium citrate）2、0.5和0.2倍体积洗脱，20 μg/mL RNA酶A 37℃消化30min，100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）含150 mmol/L NaCl洗3次。1%Blocking solution（100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）含150 mmol/L NaCl），室温封闭1 h，在含Anti-dig antibody（1∶4 000）的Blocking solution中，室温孵育2 h，100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）含150 mmol/L NaCl和50 mmol/L MgCl2洗3次，然后氯化硝基四氮唑蓝-四唑硝基蓝（NBT/ BCIP）显色，NikonAZ100显微镜观察拍照。重复以上实验6次。

2 结果与讨论

2.1 生物信息学分析

pcDNA3.0-Djtraf3的 cDNA全长为 746 bp（图1）。由图1可知：最大开放阅读框为564 bp，编码的蛋白质含187个氨基酸，蛋白相对分子质量大小约为 2.13×104。蛋白序列经 NCBI的BLAST比对，发现该蛋白包含1个MATH（meprin and TRAF-C homology）superfamily结构域，也即TRAF结构域，包含约150个氨基酸残基，预测其底物结合区位于98～159位氨基酸区域内，与其他动物类群的TRAF3氨基酸序列比对发现，该蛋白与果蝇相似度约23%，与斑马鱼相似度约36%，与哺乳动物相似度高达35%～39%。利用DNASTAR软件包中的MegAlign程序对各物种的TRAF3蛋白序列中TRAF结构域进行比对，结果显示TRAF3蛋白中的TRAF结构域具有高度保守性，尤其是TRAF-C区域（图2）。利用Philip3.5c软件包，采用邻位相连法，Cavia porcellus的TRAF2为外类群（GenBank登录号：XP_003473154.1），1 000次重复，对代表物种的TRAF3蛋白进行进化分析，结果见图3。由图3可知：DjTRAF3和果蝇的TRAF3聚群，位于进化树的基部，属于TRAF3的原始类型。

图1 pcDNA3-Djtraf3菌落不同温度梯度的PCR检测结果Fig.1 PCR results from recombinant pcDNA3-Djtraf3 plasmid

2.2 Djtraf3在涡虫整体和再生过程中的时空表达

利用地高辛标记的探针进行原位杂交，不含探针的空白对照组成体涡虫，结果见图4。由图4可知：不含探针的空白对照组没有出现阳性信号；Djtraf3阳性信号遍于涡虫整个肠上，而且重复实验结果一致。这表明，Djtraf3特异性地表达于成熟涡虫的肠。同时，在涡虫再生过程中的不同时间和不同切段，阳性信号均广泛分布于切段和新再生的肠，再生7 d后恢复到类似于成虫的表达图式（图 5），而在涡虫的再生胚基中，未观察到Djtraf3的表达，由此推测，Djtraf3基因可能在涡虫再生过程中并不发挥作用，而主要是参与涡虫的先天免疫。

目前，已在从低等到高等的多种生物体内（如线虫、果蝇、斑马鱼、鼠、人等）中发现了traf3基因的存在，涡虫在该基因进化历程中属于较原始类群。哺乳动物的TRAF结构域可以介导TRAFs成员和受体、TRAFs成员之间、TRAFs成员和一些胞内蛋白或信号分子的相互作用。TRAF结构域包含约200个氨基酸残基，可划分为TRAF-N和TRAF-C两部分［16-17］。 TRAF-C区域为高度保守的氨基酸同源结构域，含160～165个氨基酸残基，可以介导TRAF分子形成同源或异源二聚体或多聚体，并分别与不同受体蛋白胞内段的TRAF结构域或胞浆中其他含有TRAF结构域的蛋白结合。TRAF-C可以与TANK、NIK等下游信号分子结合［18］。TRAF-N含有周期排列的疏水性氨基酸残基，可形成环-环α螺旋结构，此结构对TRAF3分子形成三聚体不可或缺［19］。哺乳动物的TRAF3分子的N端都含有1个RING指模序结构，RING指模序结构后有5～7个锌指结构域［20］。RING指模序介导DNA-蛋白质以及蛋白质-蛋白质间的相互作用，同时还与NF-κB的激活相关，之后还发现环指结构参与TRAFs的蛋白酶体依赖的降解过程［21］，而锌指结构域对NF-кB和JNK的激活都十分重要，TRAF-N能与c-IAPI和c-IAPZ等抗凋亡分子相互作用［22］。本实验研究表明涡虫的 Djtraf3基因编码的蛋白亦含有 1个TRAF结构域，且其TRAF-C区域高度保守，因而推测DjTRAF3在涡虫体内也有类似作用机制。同时，笔者通过DIG-labeling RNA探针和原位杂交技术确定了Djtraf3基因在涡虫整体的具体位置和在不同再生阶段的表达位置，结果显示，Djtraf3在涡虫成体及不同再生阶段均一致表达于整个肠上，因而推测其参与涡虫的先天免疫，是涡虫免疫信号通路中的一个调试蛋白，抵抗外界病原微生物的入侵。

图2 DjTRAF3蛋白序列与其他代表物种的TRAF3氨基酸序列比对Fig.2 Alignment of amino acid sequences of TRAF3 proteins including DjTRAF3

图3 DjTRAF3和其他物种TRAF3蛋白序列的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of DjTRAF3 and other animal TRAF3 proteins

图4 Djtraf3基因在涡虫成体的表达模式Fig.4 Expression patterns of Djtraf3 in adult intact

3 结论

研究发现，涡虫TRAF3属于TRAF3的原始类型，可能在涡虫的天然免疫中发挥作用，对于丰富TRAF3的进化意义以及进一步阐明其作用机制、攻克相关疾病提供了依据和方向。

图5 Djtraf3基因在涡虫不同再生阶段中的表达模式Fig.5 Expression patterns of Djtraf3 in regenerating planarians during different stages

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（责任编辑 荀志金）

Expression of Djtraf3 in planarian Dugesia japonica

FAN Xiaojing，ZHOU Luming，LIU Dianchen，ZHAO Bosheng
（Laboratory of Developmental and Evolutionary Biology，School of Life Sciences，Shandong University of Technology，Zibo 255049，China）

Tumor necrosis factor receptor-associated factors 3（TRAF3）takes part in immune response in animals by mediated TLRs signal pathway.The cDNA Djtraf3 encoding a planarian TRAF3，contained a 564 bp open reading frame corresponding to a deduced protein of 187 amino acids，and a TRAF conservation domain.Phylogenetic analysis shows that DjTRAF3 and Drosophila melanogaste TRAF3 proteins are grouped together，and falling at the base clade.The study probed the expression patterns of Djtraf3 in adult and different regeneration courses of planarian Dugesia japonica.The results showed that Djtraf3 located in digestive system in homeostasis and regeneration.These findings provide the basis and direction for further exploring its function.

Dugesia japonica；Djtraf3 gene；DIG-labeling RNA probe；whole-mount in situ hybridization

Q785

A

1672-3678（2015）02-0047-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.009

2014-01-06

山东省自然科学基金（ZR2013CM011）

范晓静（1986—），女，山东济宁人，硕士研究生，研究方向：发育与进化生物学；赵博生（联系人），教授，E-mail：zhaobosheng@sdut.edu.cn