冯玲然，王 强，罗 玮，余晓斌

（江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）

普洱茶中功能性微生物的筛选及其对普洱茶感官品质的影响

冯玲然，王 强，罗 玮，余晓斌

（江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）

普洱茶的渥堆发酵过程是以晒青毛茶的内含成分为基础，在微生物分泌的胞外酶及湿热作用下，发生一系列化学变化，最终形成普洱茶独特的风味。采用稀释涂布法，根据产酶微生物的特性，经过固体平板初筛和液体茶汤培养基复筛，从普洱茶中分离得到若干株产酶菌株，并从中挑选优良菌株接种普洱茶固体发酵，考察其对普洱茶感官品质的影响。经分子生物学鉴定，D13-16为米曲霉（Aspergillus oryzae），相似度为98.62%；GJ-02为米根霉（Rhizopus cryzae），相似度为98.57%；XW-10和DF-03均为黑曲霉（Aspergillus niger），相似度分别为99.10%和99.92%。结果表明：普洱茶香气的形成主要与蛋白酶产生菌有关，DB-16发酵后香气评分达到31分（对照28，总分40）；汤色主要受多酚氧化酶产生菌的影响，DF-03发酵后汤色评分达到19分（对照12，总分20）；而这四种功能性微生物均在不同程度上促进了普洱茶滋味的形成。

普洱茶；筛选；微生物；酶；感官品质

普洱茶是以中国云南大叶种茶树的鲜叶经过杀青、揉捻、干燥等工艺程序制备而成的晒青毛茶为原料，再经过渥堆发酵而成的散茶和紧压茶。如今普洱茶生产工艺将古代制法的晒青和现代制法的渥堆发酵结合，赋予其更独特的风味。普洱茶在发酵过程中的功能性微生物与其陈香、醇厚、甘甜、丝滑等风味品质特点是分不开的［1-2］。微生物分泌的胞外酶（如多酚氧化酶、纤维素酶、果胶酶和蛋白酶等）催化普洱茶生茶中茶多酚的氧化缩合、蛋白质的降解、碳水化合物的分解以及各产物之间的聚合等一系列复杂反应［3-4］。在发酵过程中，大分子碳水化合物被分解为小分子的糖及可溶性糖，可溶性糖是构成普洱茶汤滋味和黏稠度的重要物质之一，同时也是在感官上表现出的所谓“甘甜”。茶叶中所含蛋白质约占干物质量的20%～30%，经过加工工艺分解为多种氨基酸，赋予普洱茶汤“醇厚”及新鲜的口感。芳香物质及糖类等，经过复杂的生物化学反应产生萜烯醇类等化合物，表现出了普洱茶特有的“陈香”风味。茶多酚在茶叶中是最具有特征性的物质，经发酵过程氧化分解为各种茶色素，赋予了普洱茶茶汤独特古朴的红褐底色［5-6］。

普洱茶的品质成分主要是在渥堆发酵过程中形成。如粗纤维、蛋白质、茶多酚和果胶等在微生物分泌的胞外酶和湿热条件的协调作用下，发生了氧化、聚合、降解、分解和转化反应，鲜、醇、甜、酸、涩、苦等风味物质综合调和，形成了普洱茶陈醇微涩的独特口感［7］。因此，考察普洱茶中的产酶功能性微生物对普洱茶品质成分的影响具有重要意义。

本研究中，笔者从普洱熟茶中筛选得到产多酚氧化酶、蛋白酶、果胶酶和纤维素酶的微生物，并将其接种普洱茶固体发酵，考察不同功能性微生物对普洱茶感官品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

所用晒青毛茶、普洱熟茶均由云南中茶茶叶有限公司提供。

1.2 培养基

奶粉培养基 牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂25g，脱脂奶粉10g，水1 000mL。pH 7.0～7.2。

果胶培养基 果胶1g，蔗糖20g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，Fe2（SO4）30.01g，K2HPO41g，NaNO33g，琼脂25g，水1 000mL。pH自然。

刚果红纤维素培养基 羟甲基纤维素钠（CMCNa）10g，（NH4）2SO42g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO41g，NaCl 0.5g，刚果红0.2g，琼脂25g，水1 000mL。pH自然。

茶叶琼脂培养基 晒青毛茶30g，水1 000mL，煮沸5min，纱布过滤去除茶渣，琼脂20g。pH 6.0，121℃灭菌20min。

液体茶汤培养基 晒青毛茶粉碎，按固液化1∶25g/mL加水混合，煮沸10min，250mL三角瓶装液50mL，pH 6.0，110℃灭菌20min。

固体发酵培养基 按m（晒青毛茶）∶m（水）= 5∶2的比例混合，充分混合后分装250mL三角瓶，每瓶20g。

1.3 试验方法

1.3.1 蛋白酶产生菌的筛选

称取普洱茶熟茶1g，加入99mL无菌生理盐水中，浸泡10min，采用稀释涂布法，将茶叶水稀释至10-3、10-4、10-5梯度，分别取100 μL涂布于奶粉培养基，37℃下培养4～5 d，观察各个菌株的生长状况，若在菌落周围出现透明的水解圈，则表明该菌具有产生蛋白酶的能力。

1.3.2 果胶酶产生菌的筛选

稀释涂布于果胶培养基，37℃下培养4～5 d，后加质量分数为 1.0%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，多糖沉淀剂），静置10min，若在菌落周围出现透明圈，则表明该菌具有产生果胶酶的能力。

1.3.3 纤维素酶产生菌的筛选

稀释涂布于刚果红纤维素培养基，37℃下培养6～7 d，观察各个菌株的生长状况，若在菌落周围出现透明圈或者菌落菌丝变红，则表明该菌具有产生纤维素酶的能力。

1.3.4 多酚氧化酶产生菌的筛选

稀释涂布于茶叶琼脂培养基，37℃下培养4～5 d，观察各个菌株的生长状况，若有褐色素产生，则表明该菌具有产生多酚氧化酶的能力。

1.3.5 游离氨基酸的测定

游离氨基酸的测定采用茚三酮比色法［8］。

1.3.6 水溶性果胶的测定

水溶性果胶的测定采用沉淀法［9］。

1.3.7 粗纤维和茶多酚的测定

粗纤维和茶多酚的测定参考文献［10］进行。

1.3.8 液体茶汤发酵条件

由于普洱茶固体发酵周期较长，为提高筛选效率，复筛采用液体茶汤发酵。将平板初筛菌种接入液体茶汤培养基中，37℃、150r/min振荡培养4～5 d。

1.3.9 固体发酵条件

将复筛得到的优良菌株接种固体发酵培养基，37℃、湿度80%的条件下培养40 d，发酵结束后进行感官评审。

1.3.10 普洱茶内质感官评审方法

普洱茶感官评定的具体描述、评价和记录参考云南省地方标准DB 53/T 103—2006普洱茶，本研究仅对普洱茶的内质进行感官评审。普洱茶内质的各指标权数为：香气40%、滋味40%、汤色20%、叶底20%，总分100分。根据各指标的等级和权数评分，具体特征等级见表1。

1.3.11 菌种鉴定

基因组提取 按照上海生工生物工程有限公司的SK1375真菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取。

PCR扩增的反应体系 50 μL的总反应体积中包含1 μL DNA模板，每个引物0.5 μL（10 μmol/L），0.5 μL dNTP Mixture（10 mmol/L），2.5 μL 10×Taq reaction Buffer，加水至25 μL。扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸8min。18s rDNA测序引物序列：NS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’；NS6：5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’NS5：5’-GTTTCTAGGACCGCCGTA-3’（中间引物，用于测序）。PCR产物经l%的琼脂糖凝胶电泳检测，紫外成像系统拍照。由PCR产物电泳结果切割所需DNA目的条带纯化，具体操作步骤见说明书。将纯化后的PCR产物送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。测定的18S rDNA序列用Blastn工具与GenBank数据库中的序列进行相似性比较分析。

表1 普洱散茶（熟茶）感官品质特征Table 1 Sensory quality characteristic of Pu-erh loose tea（ripe tea）

2 结果与讨论

2.1 蛋白酶产生菌的筛选

蛋白酶可催化普洱茶中蛋白质水解形成氨基酸，能改善普洱茶的鲜爽度和香气，提高茶汤质量。本研究利用奶粉培养基从熟茶茶样中筛选出若干株蛋白酶产生菌，根据菌落周围透明圈大小，挑选出DB-07、DB-08、DB-13、DB-16和DB-20这5株较优菌株做进一步液体茶汤发酵试验，结果见图1。由图1可知：游离氨基酸的含量明显上升，其中菌株DB-16效果最佳。根据文献［5，11］报道，在普洱茶发酵过程中，蛋白酶的作用并不能使游离氨基酸的含量升高，熟茶中游离氨基酸含量反而比生茶中的含量低。这是由于在普洱茶固体发酵过程中，氨基酸发生氧化分解和转化，形成香气物质，并且能够与茶多酚的氧化分解产物结合形成茶褐素等物质。而在液体茶汤发酵过程中，菌种单一，氨基酸很少发生分解和转化，而且已测试这几株菌株不分泌多酚氧化酶。所以，在微生物分泌的蛋白酶催化作用下，茶汤中游离氨基酸含量明显上升。

图1 初筛菌株对游离氨酸含量的影响Fig.1 Effects of different strains on free amino acids content

2.2 果胶酶产生菌的筛选

从果胶培养基上挑选出GJ-02、GJ-08、GJ-09、GJ-13和GJ-17这5株透明圈/菌落直径比例大的菌株做进一步复筛试验，结果见图2。由图2可知：发酵结束后，水溶性果胶含量明显升高，其中接种菌株GJ-02的实验组比对照提升了近4倍。在茶叶加工过程中，鲜叶中的原果胶在果胶酶的作用下水解成水溶性果胶和阿拉伯糖、半乳糖等物质参与滋味品质的形成。水溶性果胶是茶汤具有味厚感和增加茶汤浓稠度并使茶汤甘醇的主要物质，其含量变化影响普洱茶的品质［12］。在普洱茶渥堆发酵过程中，原果胶和水溶性果胶成波动变化，但总体趋势是原果胶减少而水溶性果胶增加［12-13］，本文的研究结果也证实了这一点。

2.3 纤维素酶产生菌的筛选

根据刚果红染色后形成的水解圈直径和菌落直径的比值，挑选产纤维素酶能力较强的菌株XW-01、XW-02、XW-06、XW-10和XW-12，将这5株菌株接种液体茶汤发酵，结果见图3。由图3可知，菌株XW-10降解茶汤中粗纤维的能力最强。廖东兴［4］研究发现，粗纤维含量在渥堆发酵过程中呈下降趋势。纤维素酶作为胞壁水解酶类，可以增加细胞壁的通透性，促进多酚类物质和游离氨基酸等的溶出，提高水浸出物的含量，有助于保障成品茶中含有丰富的水浸出物。

图2 初筛菌株对水溶性果胶含量的影响Fig.2 Effects of different strains on water-soluble pectin content

图3 初筛菌株对粗纤维含量的影响Fig.3 Effects of different strains on crude cellulose content

2.4 多酚氧化酶产生菌的筛选

多酚氧化酶是一种含铜氧化酶，在普洱茶发酵过程中，它将茶多酚氧化成茶色素类物质，赋予普洱茶红艳明亮、经久耐泡的特性。笔者从固体茶叶平板上挑选出DF-03、DF-11、DF-16、DF-21、DF-28和DF-34这6株生长旺盛、褐色色素产量高的菌株做进一步液体茶汤发酵试验，结果见图4。由图4可知，菌株DF-03降解茶多酚能力最强。与对照相比，茶多酚含量从26.8%下降到11.8%。杨希等［14］接种黑曲霉、米曲霉以及红曲霉进行普洱茶发酵，茶多酚含量分别下降 10%、12.5%和 13.5%，并且茶汤色发生明显变化。梁名志等［15］研究人工接种对普洱茶化学成分影响发现，采用人工接种真菌，普洱茶中的茶多酚由生茶的28.88%下降到18.02%。多酚氧化酶可催化茶多酚氧化分解成茶色素类物质，茶色素类物质中含有茶多酚氧化产物、蛋白质、糖类和咖啡碱等物质，成分十分复杂，而茶黄素、茶褐素和茶红素三者的含量和比例对普洱茶的汤色和叶底又有着直接的关系［16］。因此，多酚氧化酶产生菌的筛选与添加对普洱茶品质成分的形成具有重要意义。

图4 初筛菌株对茶多酚含量的影响Fig.4 Effects of different strains on tea polyphenols content

2.5 菌株的初步鉴定

根据《真菌鉴定手册》［17］、《酵母菌的特征与鉴定手册》［18］和《伯杰细菌鉴定手册》［19］对所筛菌株进行形态学和生理生化鉴定。鉴定结果表明，所筛菌株绝大多数为霉菌，仅有少量酵母和细菌。其中，产蛋白酶菌株DB-16菌落生长较快，质地疏松，初呈淡黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，可利用多种基质生长，初步判断为米曲霉；产果胶酶菌株GJ-02菌落最初呈白色，后变为灰褐色，菌丝匍匐爬行，无色，假根发达，分枝呈根状，褐色，初步判断为根霉；产纤维素酶菌株XW-10和产多酚氧化酶菌株DF-03菌落生长迅速，分生孢子头呈放射状，产酶丰富，孢子颜色分别呈褐色和黑色，初步判断均为黑曲霉，但菌落形态（尤其是孢子颜色和数量）差异明显，初步判断并非同一株菌。再将DB-16、GJ-02、XW-10和DF-03的18s rDNA序列提交GenBank数据库，利用Blastn工具进行序列比对，对这3株菌进行序列相似性分析。分子生物学鉴定结果表明，DB-16为米曲霉（Aspergillus oryzae），相似度98.62%；GJ-02为米根霉（Rhizopus oryzae），相似度98.57%；XW-10和DF-03均为黑曲霉（Aspergillus niger），相似度分别为 99.10%和99.92%。

2.6 微生物对普洱茶感官品质的影响

分别挑选产4种酶的微生物中的优良菌株，接种普洱茶固体发酵。发酵结束后，根据云南省地方标准DB 53/T 102-2003对四组茶叶进行内质感官评审，评审结果见表2。与对照相比，蛋白酶产生菌DB-16明显提升了普洱茶香气和滋味。这是由于蛋白酶将茶叶中的蛋白质水解成游离氨基酸，而氨基酸一方面直接提高普洱茶的鲜爽度，相对降低普洱茶的苦涩味，另一方面又可分解转化成香气物质，或与多酚氧化产物形成茶色素类物质［5］。果胶酶产生菌GJ-02对普洱茶滋味的提升较大。普洱茶中原果胶在果胶酶的催化作用下水解成水溶性果胶和其他可溶性糖类，水溶性果胶是普洱茶醇厚口感的直接决定因素，可溶性糖又可降低普洱茶的苦涩味，两者共同赋予其“浓醇甘夷”的特性［12］。纤维素酶产生菌XW-10对普洱茶整天感官特性都有所提升，但幅度不大。这是由于纤维素酶改变了细胞壁的通透性，促进了普洱茶中可溶性糖和氨基酸等的释放。多酚氧化酶产生菌DF-03对普洱茶滋味和汤色的提升较为明显。多酚氧化酶一方面大大降低了茶多酚的含量，改善了普洱茶的滋味；另一方面，茶多酚的降解产物茶色素对普洱茶的汤色起着决定性的作用。茶黄素、茶红素和茶褐素的含量和比例赋予普洱茶红艳明亮的独特品质［14，16］。普洱茶的发酵是茶叶内的物质在各种微生物分泌的胞外酶和水热作用下，发生降解、转化、聚合等反应，最终形成独特的风味。普洱茶自然发酵过程中，微生物种类繁多，功能各异，但并非没有规律可循［20］。

表2 微生物对普洱茶感官品质的影响Table 2 Effects of different functional microbes on sensory quality of Pu-erh tea

3 结论

蛋白酶产生菌可明显增加液体茶汤中游离氨基酸的含量，DB-16最为明显；果胶酶产生菌的接入促使液体茶汤中水溶性果胶含量明显升高，其中接种菌株GJ-02的实验组较对照提升了近4倍；纤维素酶产生菌可分解普洱茶中粗纤维，促进可溶性糖及其他物质的溶出，其中XW-10效果最佳；在茶多酚降解菌株中，DF-03的能力最强，茶多酚含量下降了15%。蛋白酶产生菌DB-16明显提升了普洱茶香气和滋味；果胶酶产生菌GJ-02对普洱茶滋味的提升较大；纤维素酶产生菌XW-10对普洱茶整天感官特性都有所提升，但幅度不大；多酚氧化酶产生菌DF-03对普洱茶滋味和汤色的提升较为明显。产酶微生物对普洱茶感官品质的提升，其实质是微生物分泌的胞外酶与普洱茶营养物质之间相互作用的结果。因此，在普洱茶渥堆发酵过程中，外源微生物或者酶的添加对提升普洱茶品质和稳定性以及缩短发酵周期具有重要意义。

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（责任编辑 荀志金）

Screening of functional microbes from Pu-erh tea and their effects on the sensory quality of Pu-erh tea

FENG Lingran，WANG Qiang，LUO Wei，YU Xiaobin
（The Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The fermentation of Pu-erh tea is a series complex chemical reaction by enzymes produced by fungi to convert chemical component of sun-dried green tea leaves，to generate unique Pu-erh flavors.In this study，we isolated some functional microbes from Pu-erh tea.After molecular identification，main microbes DB-16 and GJ-02 are identified as Aspergillus oryzae and Rhizopus oryzae，respectively；DF-03 and XW-10are Aspergillus niger.Then these strains were inoculated to Pu-erh tea fermentation to study their effects on sensory quality of Pu-erh tea.The results show that Pu-erh tea's aroma is mainly connected with proteinase-producing strain with anaroma score of 31（control 28，total score 40）after inoculating DB-16；the liquor color is mainly affected by polyphenol oxidase-producing strain with a liquor color score of 19（control 12，total score 20）after inoculating DF-03.All of these strains stimulated the development of Pu-erh tea's aroma and color.

Pu-erh tea；screening；microbe；enzyme；sensory quality

TS272.5

A

1672-3678（2015）02-0093-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.018

2014-01-10

江苏省高校优势学科建设工程（111-2-06）

冯玲然（1988—），女，河南南乐人，硕士研究生，研究方向：微生物学；余晓斌（联系人），教授，E-mail：xbyu@jiangnan.edu.cn