基于线粒体DNA D-loop区全序列分析藏鸡遗传多样性及其起源进化关系的研究

贾晓旭，唐修君，陆俊贤，顾荣，葛庆联，高玉时*，苏一军

（江苏省家禽科学研究所，江苏扬州225125）

摘要：通过对藏鸡线粒体DNA（mtDNA）Dloop区全序列的测序和比对，结合GenBank已经测出Dloop区全序列的部分品种鸡的序列，探讨藏鸡的遗传多样性和母系起源。结果表明，藏鸡DNA（mtDNA）Dloop区全长1 231~ 1 232 bp、1 231 bp单倍型在859 bp处存在C碱基缺失。在20只个体中，共发现20处单核苷酸多态位点，7种单倍型。系统发育分析发现，藏鸡7种单倍型可以分为A、B、E三个分支。A分支与红色原鸡（Gallus gallus murghi）聚为一类，推测可能起源于红色原鸡的印度亚种分支，B和E与红色原鸡滇南亚种（Gallus gallus spadiceus）聚为一类，推测这两个分支可能起源于云南、缅甸附近地区的红色原鸡滇南亚种。研究从分子水平上为藏鸡的遗传资源保护和开发利用提供参考

关键词：藏鸡；线粒体DNA；D-loop区；系统发育关系；起源

网络出版时间2015-1-27 16:00:16 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150127.1600.006.html

贾晓旭,唐修君,陆俊贤,等.基于线粒体DNA D-loop区全序列分析藏鸡遗传多样性及其起源进化关系的研究[J].东北农业大学学报, 2015, 46(2): 32-36.

藏鸡是我国青藏高原上具有特殊种质特性的地方品种，对高原恶劣气候和低氧环境有良好适应能力。具有耐粗放饲养、抗病力强、肉质鲜嫩等优点，但由于蛋小、生长缓慢、开产较晚等缺点，亟需对其进行遗传改良[1]。

线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）具有母系单倍体遗传特性、在世代传递过程中不发生DNA重组、较核DNA突变率高及进化速率快等优点，能反映物种母系迁徙历史，利于了解物种驯化经历[2-4]。mtDNA控制区（D-loop区）进化速率较其他区域高5~10倍。因此，D-loop区序列是对亲缘关系较近群体进行遗传分化研究的理想分子标记。已被广泛用于家禽起源与进化、群体遗传结构、品种间系统发育关系等方面研究[5-6]。为从母系遗传角度阐明藏鸡群体的遗传变异状况和母系血统来源，本文测定藏鸡线粒体DNA D-loop区全序列，从分子水平上探讨藏鸡的起源和遗传多样性，为藏鸡种质资源保护、利用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1试验动物

20只藏鸡采集于国家地方禽种资源基因库，随机取样，翅静脉采血，ACD抗凝，采用常规的酚/氯仿法提取血液基因组DNA，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。选取红色原鸡三个亚种（指名亚种Gallus gallus spadiceus、滇南亚种Gallus gallus spadiceus、印度亚种Gallus gallus spadiceus）、西藏临近国家（老挝、印度尼西亚）当地土著品种、临近省份（云南、新疆、湖南）品种，对世界家禽品种培育做出重要贡献的白洛克、白来航、洛岛红、新汉夏等已经测出线粒体DNA D-loop区全序列的14个品种，从GenBank数据库中下载其线粒体DNA D-loop区全序列（见表1），与藏鸡进行系统发育分析。

1.2方法

1.2.1引物合成

根据红色原鸡线粒体基因组已知DNA序列（GenBank序列号: NC_007235）用Primer Premier 5.0软件设计1对引物扩增藏鸡线粒体DNA的D-loop区，引物序列分别为: PF：5' AAACACCCAAACTC ACTAAC 3'；PR：5' CACTGGGATGCGGATACTTG C 3'。交于上海生工生物有限公司合成。

1.2.2 PCR扩增和测序

PCR扩增体系（50 μL）：PCRMix（南京博尔迪公司）25 μL，10 μmol·L-1引物各1.5 μL，模板2 μL，灭菌水20 μL。反应程序为：95℃5 min，（95℃30 s，53℃60 s，72℃60 s）30循环，72℃4 min。1.5%低溶点琼脂糖(Promega公司）凝胶电泳检测PCR产物，用试剂盒回收纯化，然后交由上海英骏公司进行测序。所有序列采用双向测序，以便比对核实。

表1　用于分类的品种序列信息Table 1　List of taxonomic samples information

1.2.3数据处理和分析

将得到的序列与GenBank中红色原鸡参考序列进行比对，剪掉引物及多余的序列，DNA序列片段经DNAStar 5.02软件的SeqMan程序拼接。用DnaSP version 5软件统计多态位点数（Number of polymorphic sites）和突变位点总数（Total number of mutations），单倍型数（Number of haplotype），单倍型多样度（Haplotype diversity），核苷酸多样度（Mucleotide diversity）等[7]。用MEGA 4.0进行转换与颠换数目的统计和碱基组成分析，并用其采用邻接法（neighbor-jointing，NJ）构建系统发育树，发育树选用Kimura 2模型，1 000次重复[8]。

2　结果与分析

2.1藏鸡线粒体DNA D-loop区序列分析

设计引物在藏鸡基因组中得到较好的扩增,通过测序发现藏鸡线粒体DNA D-loop区序列全长除1只为1 231 bp外（859 bp处C碱基缺失），其余均为1 232 bp。T、C、A和G 4种碱基含量分别为33.5%、26.5%、26.7%和13.3%，其中A+T含量（60.2%）明显高于G+C含量（39.8.2%），与其他家禽品种线粒体DNA D-loop区序列的碱基组成基本一致[9-10]。藏鸡mtDNA D-loop区核苷酸多样性为（0.00475±0.00481），单倍型多样性为（0.774± 0.065），表现出丰富的线粒体遗传多样性。从图1可以看出，藏鸡D-loop区在第1到第132 bp之间没有发现碱基变异，说明这是相对保守的一个区域，变异区在第133与1 215 bp之间，而高变区主要集中在第212~330 bp之间，长度占全长的10% （118/1 232），却集中60%（12/20）的碱基变异。

2.2藏鸡线粒体DNA D-loop区单倍型分析

通过DnaSP软件进行单倍型统计分析，藏鸡群体D-loop区序列中检测到20个多态位点，并由此界定7个单倍型（Hap1~Hap7见图1）。其中单倍型1和单倍型5均有7个个体，为优势单倍型。利用藏鸡mt DNA D-loop区7个单倍型构建NJ系统发生树，从图1、2可以看出，单倍型可以分为A、B、E三个分支。其中A分支仅有1种单倍型，1个个体；B分支有2种单倍型，8个个体；E分支有4种单倍型，11个个体。

图2　7种单倍型藏鸡线粒体DNA D-loop区系统发育树Fig. 2　Neighbor-joining phylogenetic tree of 7 mtDNAD-loop haplotypes of Tibetan chicken

2.3藏鸡与其他品种间的系统发育分析

根据藏鸡线粒体DNA D-loop区全序列A、B、E三个分支，采用NJ法构建藏鸡与其他品种的系统发育树（见图3）。

由图3可知，藏鸡A分支与新汉夏、白洛克、白来航、原鸡印度亚种聚为一类，节点的BP值为78；而老挝土著鸡、新疆吐鲁番鸡与原鸡指名亚种聚为一类。藏鸡B分支与洛岛红、云南赤轱辘鸡、湖南桃源鸡、原鸡滇南亚种（云南）聚为一类，节点的BP值为94；藏鸡E分支先与云南江边鸡聚为一类，再与印度尼西亚斗鸡聚为一类，最后与原鸡滇南亚种（缅甸）聚为一类，节点的自举置信度（BP）为98。藏鸡B与E分支亲缘关系较近，同在一个大的支系。

图3　基于线粒体DNA D-loop区序列采用N-J法构建的系统发育树Fig. 3　Neighbor-joining tree based on populations mtDNA D-loop sequences

3　讨论与结论

3.1藏鸡mtDNAD-loop区结构特征

国内外有关鸡mtDNA D-loop区研究大都集中在高变区[11-13]，一般小于600 bp，区域较小，得到的信息可能不全面。本研究发现藏鸡Dloop区全长1 231~1 232 bp，1 231 bp单倍型在859 bp处存在C碱基缺失，藏鸡D-loop区在738、792、900、1 215 bp处存在碱基转换或颠换。因此笔者认为用mtDNA D-loop区全序列进行遗传多样性和起源进化分析更为准确。

群体mtDNA变异程度的两个重要指标是单倍型多样度和核苷酸多样度。二者值越大，遗传多样性越丰富，群体多样性程度越高。在20只个体中，共发现20处单核苷酸多态位点，7种单倍型，核苷酸多样性为（0.00475±0.00481），单倍型多样性为（0.774±0.065），表现出丰富的线粒体遗传多样性。变异区在第133个碱基与1 215个碱基之间，而高变区主要集中在第212~330碱基之间。

3.2藏鸡母系起源

Fumihito等研究表明红色原鸡为家鸡的野生祖先[14]，由多个母系在中国南部、南亚和东南亚经过多次独立驯化[15]。本研究结果显示，藏鸡可划分为A、B、E三个分支，由于mtDNA呈母系遗传，以上结果揭示藏鸡在遗传组成上具有3个血统来源。

藏鸡群体主要分布于分支B和E中，分别与原鸡滇南亚种（缅甸）和原鸡滇南亚种（云南）聚为一类，其母系可能起源于缅甸和云南的原鸡滇南亚种（Gallus gallus spadiceus），分支A群体数量较少，与原鸡印度亚种聚为一类，母系可能起源于原鸡印度亚种（Gallus gallus murghi）。这与Niu等和Liu等中国家鸡多个母系起源的研究结果一致[16-17]。吐鲁番斗鸡和老挝土鸡与原鸡指名亚种聚为一类，可能起源原鸡指名亚种（Gallus gallus gallus）。

3.3藏鸡与其他品种的亲缘关系

藏鸡B和E分支与我国地方品种江乡鸡、赤轱辘鸡、桃源鸡聚到一起，这与发生地方品种间杂交有关。鸡E分支与印度尼西亚斗鸡聚为一类，藏鸡习性富于神经质，好斗性强，也可能与含有斗鸡血缘有关。藏鸡B分支与洛岛红一类，洛岛红育成较晚，是由红色马来斗鸡、褐色来航鸡和九斤黄鸡杂交而成，由于聚类分析B分支与白来航亲缘关系较远，推测藏鸡B分支与洛岛红的母系九斤黄或马来斗鸡共同血缘。藏鸡A分支个体较少，与大部分藏鸡个体亲缘关系较远，与白来航和白洛克等国外优秀品种聚为一类，可能是人为杂交结果，也可能具有共同母系血缘，可考虑对其生产性能做进一步研究。

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Jia Xiaoxu, Tang Xiujun, Lu Junxian, et al. Investigation of genetic diversity and evolution of Tibetan chicken based on complete mitochondrial DNA D-loop region sequence[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(2): 32-36. (in Chinese with English abstract)

Investigation of genetic diversity and evolution of Tibetan chicken

based on complete mitochondrial DNA D-loop region sequence

/JIAXiaoxu, TANG Xiujun, LU Junxian, GU Rong, GE Qinglian, GAO Yushi, SU Yijun

(Jiangsu lnstitute of Poultry Science, Yangzhou Jiangsu 225125, China)

Abstract:To determine the origin and genetic diversity of Tibetan chicken, we analyzed its complete mtDNA D-loop sequences and the available chicken sequences in GenBank. The results showed that, the D-loop region of Tibetan chicken was 1 231-1 232 bp, the 1 231 bp haplotype existed a base C deficiency within 859 site. In the 20 samples assayed,20 mutation sites and 7 haplotypes were found. Phylogenetic analysis found that 7 haplotypes of Tibetan chicken converged into three clades. The clade A were clustered with Gallus gallus murghi, the cluster results indicated clade A may originated from the continental subspecies of Gallus gallus murghi of India or its surrounding areas.The clade B and Clade E and were clustered with Gallus gallus spadiceus, the cluster results indicated two clades may originated from the continental subspecies of Gallus gallus spadiceus of Yunnan or

Myanmar or its surrounding areas. The study results will be a reference for genetic resources conservation and development and utilization of Tibetan chicken.

Key words:Tibetan chicken; mitochondrial DNA; D-loop region; phylogenetic relationship; origin

*通讯作者：高玉时，研究员，硕士生导师，研究方向为家禽遗传育种与品质评价。E-mail: gaoys100@sina. com

作者简介：贾晓旭（1982-），男，助理研究员，硕士，研究方向为家禽遗传育种与品质评价。E-mail: 596374801@qq. com

基金项目：国家自然科学基金（31372277）

收稿日期：2014-07-04

文章编号：1005-9369（2015）02-0032-05

文献标志码：A

中图分类号：S831.2