王娇 黄熙

氨基酮戊酸光动力疗法对鲜红斑痣动物模型鸡冠的影响

王娇 黄熙

目的 探讨外用氨基酮戊酸光动力疗法（ALA-PDT）对鲜红斑痣（PWS）动物模型鸡冠的作用和治疗鲜红斑痣的可行性。方法 80只莱亨鸡随机分为10组：空白对照组、单纯ALA组、单纯激光75 J/cm2组、100 J/cm2组、150 J/cm2、200 J/cm2组，ALA-PDT 75 J/cm2组、100 J/cm2组、150 J/cm2组、200 J/cm2组。单纯激光组仅给予630 nm红光照射，ALA-PDT组外用ALA后给予红光照射。干预14 d、28 d分别取材，观察鸡冠形态学、组织学变化，计算毛细血管减少率和血管内皮细胞凋亡情况。结果 外用ALA-PDT 75 J/cm2、100 J/cm2、150 J/cm2和200 J/cm2组鸡冠实验区域颜色变淡，光镜下真皮毛细血管数目减少、管径变小，部分血管内皮细胞凋亡；毛细血管减少率分别为33.53%±4.89%、52.02%±2.77%、67.48%±5.58%、88.96%±2.47%；凋亡指数分别为：63.44±1.09、88.50±6.11、94.32± 3.67、113.76±10.57，与其余各组分别比较，均P<0.01；血管内皮细胞凋亡深度分别为：201.19 μm ± 0.33 μm、266.15 μm ± 1.02 μm、546.09 μm ± 2.45 μm、766.37 μm ± 1.08 μm，各组间两两比较，均P<0.01。结论 外用ALA-PDT对鸡冠毛细血管有明显损伤，损伤程度和深度与红光能量密度相关；诱导血管内皮细胞凋亡可能是其治疗机制之一。

葡萄酒色痣；氨基酮戊酸；光化学疗法；细胞凋亡；模型，动物；鸡冠

作者单位：541001广西，桂林医学院附属医院皮肤科

光动力疗法（PDT）已作为多种组织特异性疾病如皮肤肿瘤的微创治疗方法［1］。近期有学者尝试运用 PDT 治疗鲜红斑痣（port wine stains，PWS），获得初步疗效［2］；其选择的光敏剂均为静脉途径给药，存在体内代谢较慢、易继发光敏反应、临床应用受限制的缺点。如何改进PDT在PWS的临床应用受到关注。氨基酮戊酸（ALA）是转化率高、避光时间短、体内沉积少、不良反应轻的第二代光敏剂［3］。有研究［4］证实，外用ALA-PDT可以损伤肿瘤血管，同时对正常毛细血管也有作用。根据这一原理，我们推测它可能适用于PWS的治疗。本实验以鸡冠为动物模型，通过观察ALA-PDT干预后鸡冠形态学、组织学变化、血管数变化以及血管内皮细胞凋亡情况，探讨ALA-PDT对鸡冠毛细血管的损伤作用及可能机制，为ALA-PDT临床治疗PWS提供实验依据。

材料与方法

一、主要试剂及仪器

氨基酮戊酸散（规格118 mg，批号110801，复旦张江生物制药有限公司），-20℃避光保存；PDT激光治疗仪（武汉亚格光电医疗器械有限公司），波长632 nm±3 nm，输出功率0～500 mW；TUNEL系列细胞凋亡测试试剂盒（美国Roche公司，POD；Cat.No.1168481 7910）；Olympus BXDX光学显微镜和照相系统（日本Olympus公司）。

二、动物分组

6月龄莱亨鸡（动物合格证号4104035）80只，体重1.7～2.5kg，鸡冠色泽红润、颜色均匀、无溃疡坏死。将实验动物随机分为10组：空白对照组、单纯ALA组、单纯激光 75 J/cm2组、100 J/cm2组、150 J/cm2、200 J/cm2组，ALA-PDT 75 J/cm2组、100 J/cm2组、150 J/cm2组、200 J/cm2组，每组8只。鸡冠一侧用龙胆紫标记1 cm×1 cm的区域为实验区域，对侧为自身对照。空白对照组不做任何处理；单纯ALA组：用灭菌注射用水将ALA稀释成20%新鲜溶液，在实验区域放置等体积灭菌纱布两层，将溶液滴于纱布上，塑料薄膜封包，用锡皮纸包扎后避光放置，2 h后重复滴加1次，持续敷药时间不少于3 h；单纯激光组：分别以能量密度 75、100、150、200 J/cm2红光照射实验区域，光斑直径1 cm，持续时间20 min，根据公式（照射功率=能量密度×照射面积/照射时间）计算输出功率；ALA-PDT组：同单纯ALA组局部外用ALA 后分别以能量密度 75、100、150、200 J/cm2红光照射实验区域。干预后实验动物相同条件下避光饲养24 h。

三、检测指标

1.一般情况：干预前肉眼观察鸡冠的形态学情况，照像以备比较；Wood灯暗视野下观察鸡冠荧光现象（单纯ALA组、ALA-PDT组去除包扎物后观察），荧光现象可反映ALA富集情况。干预即刻、7、14、28 d肉眼观察各组动物及实验区域一般情况和形态变化。

2.HE染色：干预14、28 d用微型环钻分别钻取各组全层鸡冠组织，以实验侧的对侧为自身对照。组织块4%甲醛固定，常规石蜡包埋，取部分切片行常规染色观察。每张切片随机选取5个高倍视野（10×400），计算毛细血管平均数，根据公式计算毛细血管减少率：毛细血管减少率=（对照侧毛细血管平均数－实验侧毛细血管平均数）/对照侧毛细血管平均数×100%。

3.TUNEL法检测：取部分剩余切片，根据TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒说明染色，观察血管内皮细胞凋亡情况。凋亡细胞胞核呈红染，凋亡小体呈较小的红色圆形小体。每张切片随机取5个高倍视野（10×400），每个视野计数200个细胞，总计1 000个，根据公式计算凋亡指数（apoptosis index，AI）：AI= 凋亡细胞数/1 000。随机选取 5 个点测量皮肤基底层至明显凋亡最深处的垂直距离，取其平均值，即为该组明显凋亡深度值。

四、统计学分析

结 果

一、Wood灯观察一般情况

Wood灯观察，空白对照组和单纯激光组实验区域无荧光现象，单纯ALA组和ALA-PDT组实验区域可见明亮砖红色荧光，判断为ALA经皮吸收后代谢为原卟啉IX（PpIX）所致，实验区域以外部分和对侧未见荧光现象。见图1，2。

二、肉眼观察

观察期内实验动物一般情况良好，无动物死亡。干预前后及观察期内，肉眼观察空白对照组、单纯ALA组、单纯激光组鸡冠外形及色泽无明显变化，仅单纯激光200 J/cm2组干预16～20 min实验区域轻微肿胀、色泽略变暗，停止干预1～3 min均恢复正常。外用ALA-PDT组实验区域干预后均出现明显的红白相间。ALA-PDT 75 J/cm2组8例、100 J/cm2组6例干预即刻实验区域轻微水肿、颜色加深，停止干预30min变成深红色；7、14、28d实验区域均为正常鲜红色，为轻度反应。ALA-PDT100J/cm2组2例、ALA-PDT150J/cm2组7例干预即刻实验区域明显肿胀、出现以白色为主的白紫色变化，停止干预10 min左右变成紫红色；7、14 d实验区域白紫色、无破溃结痂，28 d恢复正常鲜红色，为中度反应。ALA-PDT150J/cm2组1例、ALA-PDT200J/cm2组8例干预即刻实验区域明显肿胀、出现灰白斑、部分表皮坏死，停止干预20 min左右变成暗紫红色；7 d创面结薄层黑痂，14 d痂皮脱落、创面愈合，28 d恢复正常颜色。各组均无瘢痕形成。

图1 Wood灯下，单纯ALA组和ALA-PDT组实验区域可见鸡冠ALA富集区域呈砖红色荧光现象（箭头）

图2 Wood灯下，空白对照组和单纯激光组实验区域 图中ALA-PDT组非实验区域为无荧光现象，中下部小块半圆形荧光为该组实验区域

图3 各组鸡冠组织光镜表现（HE×400） 3A～3C：分别为正常对照组、单纯ALA组、单纯激光组：表皮正常，乳头层大量扩张毛细血管，腔内充满红细胞；3D：ALAPDT 75 J/cm2组干预14 d表皮极轻微增生，乳头层血管数量略减少、管径略缩小；3E：ALA-PDT组100 J/cm2组干预14 d表皮轻微增生，乳头层血管明显减少、部分闭锁；3F：ALA-PDT 150 J/cm2组干预14 d表皮细胞明显增生，乳头层血管数量明显减少、大部分闭锁；3G：ALA-PDT组200 J/cm2干预14 d表皮细胞变性、灶性坏死，乳头层毛细血管大量减少，溃疡、水肿，严重凝固性坏死；3H～3K：ALA-PDT 75 J/cm2组、100 J/cm2、150 J/cm2、200 J/cm2组干预28 d表皮细胞增生，乳头层毛细血管减少

三、HE染色

干预14、28 d，空白对照组、单纯ALA组、单纯激光组与自身对照比较，组织学表现无明显变化，光镜下可见实验区域表皮正常，真皮乳头层可见大量扩张的毛细血管、腔内充满红细胞，血管内皮细胞完整，内皮下有不连续的平滑肌层。ALA-PDT 75 J/cm2组 8例、100 J/cm2组 8例、150 J/cm2组 6例干预14 d实验区域表皮细胞增生、水肿，乳头层毛细血管减少、管腔内红细胞减少；干预28 d实验区域表皮细胞增生，乳头层部分血管闭锁，新生毛细血管生成，为中度反应。ALA-PDT 150 J/cm2组2例、200 J/cm2组8例干预14 d实验区域表皮细胞灶性缺失伴明显增生，乳头层毛细血管大量减少，溃疡、水肿，严重凝固性坏死；干预28 d表皮细胞明显增生，乳头层大量血管闭锁，偶见新生毛细血管，为重度反应。见图3。

四、毛细血管减少率

与空白对照组比较，单纯ALA组、单纯激光组毛细血管减少率均P>0.05，说明单纯ALA和单纯激光照射无治疗作用。ALA-PDT组较空白对照组毛细血管减少率相比，差异有统计学意义（P<0.01），说明外用ALA并红光照射有治疗作用。4种不同能量密度ALA-PDT组之间比，均P<0.01，说明其作用强度与能量密度呈正相关。见表1。

表1 鸡冠干预14 d、28 d各组毛细血管减少率（%，±s）

表1 鸡冠干预14 d、28 d各组毛细血管减少率（%，±s）

注：n=8。a：各组与空白对照组比较P<0.01；b：各组与单纯ALA组比较P<0.01；c：ALA-PDT组与相同能量密度的单纯激光组比较P<0.01；d：ALA-PDT 75 J/cm2组与ALA-PDT其他组比较P<0.01；e：ALA-PDT 100 J/cm2组与 ALA-PDT 其他组比较 P<0.01；f：ALA-PDT 150 J/cm2组与 ALA-PDT 其他组比较 P<0.01；g：ALAPDT 200 J/cm2组与ALA-PDT其他组比较P<0.01

组别 14 d 28 d空白对照组 1.48±1.04 1.00±2.34单纯ALA组 0.74±0.41 1.74±0.25单纯激光75 J/cm2组 0.91±0.64c 2.01±1.56 100 J/cm2组 1.12±1.77c 0.33±1.09 150 J/cm2组 0.38±1.96c 0.00±0.34 200 J/cm2组 0.00±1.44c 0.08±0.34 ALA-PDT 75 J/cm2组 33.53±4.89abefg 29.45±3.27 100 J/cm2组 52.02±2.77abdfg 53.89±1.76 150 J/cm2组 67.48±5.58abdeg 58.64±3.42ab 200 J/cm2组 88.96±2.47abdef 91.32±1.68ab

五、TUNEL法检测血管内皮细胞凋亡

干预14 d，空白对照组、单纯ALA组、单纯激光组镜下偶见血管内皮细胞凋亡，其凋亡指数（AI）两两比较差异均P>0.05。ALA-PDT组血管内皮细胞凋亡与自身对照及其他组相比显著增加，差异均有统计学意义（P<0.01）；随能量密度增加AI增大，各组之间两两比较均P<0.01。见表2。

表2 干预14 d各组血管内皮细胞凋亡指数（±s）

表2 干预14 d各组血管内皮细胞凋亡指数（±s）

注：n=8。a：各组与空白对照组比较P<0.01；b：各组与单纯ALA组比较P<0.01；c：ALA-PDT组与相同能量密度的单纯激光组比较P<0.01；d：ALA-PDT 75 J/cm2组与 ALA-PDT 其他组比较 P<0.01；e：ALA-PDT 100 J/cm2组与 ALA-PDT 其他组比较 P<0.01；f：ALAPDT 150 J/cm2组与 ALA-PDT 其他组比较 P<0.01；g：ALA-PDT 200 J/cm2组与ALA-PDT其他组比较P<0.01

组别 凋亡指数空白对照组 1.05±0.76单纯ALA组 1.38±0.52单纯激光75 J/cm2组 1.21±0.35c 100J/cm2组 1.37±0.98c 150 J/cm2组 1.24±1.78c 200 J/cm2组 1.22±0.47c ALA-PDT 75 J/cm2组 63.44±1.09abefg 100 J/cm2组 88.50±6.11abdfg 150 J/cm2组 94.32±3.67abdeg 200 J/cm2组 113.76±10.57abdef

六、血管内皮细胞明显凋亡深度

干预 14 d，ALA-PDT各组血管内皮细胞明显凋亡深度分别为 （201.19± 0.33）μm、（266.15±1.02）μm、（546.09±2.45）μm、（766.37±1.08）μm，两两比较，均P<0.01。见图4。

图4 ALA-PDT组干预14 d血管内皮细胞明显凋亡深度（×100） 4A：ALA-PDT 150 J/cm2组血管内皮细胞明显凋亡深度606.09 μm；4B：ALA-PDT 200 J/cm2组血管内皮细胞明显凋亡深度820.10 μm

讨 论

鸡冠真皮乳头层丰富的毛细血管网与PWS的组织病理学表现极其相似［5］，鸡与人血液光吸收特性基本相同［6］。因此，鸡冠一般作为PWS的实验动物模型。PDT疗法具有靶组织选择特异性，光敏剂可被靶组织选择性富集，在适当波长、能量密度光波的局部照射以及组织氧的相互作用下产生活性氧物质，活性氧物质主要通过诱导靶组织的直接坏死和细胞凋亡来达到治疗目的［1］。PDT的疗效取决于光敏剂和光源。近年来，内源性光敏剂如血卟啉、癌光啉、血卟啉甲醚［2，5］等诱导的PDT临床治疗PWS初步取得疗效。但这些光敏剂使用后需避光4～8周，光敏反应时有发生，临床应用受到限制。ALA是血红蛋白合成途径中天然存在的卟啉前体，在细胞内经酶催化后转变成原卟啉IX（PpIX），接受一定能量的激发光源照射发生光化学反应［7］。外用ALA-PDT目前临床主要用于治疗日光性角化病［7］、Bowen 病、尖锐湿疣等皮肤增生性疾病［1］。Reid 等［8］在对外用ALA-PDT治疗增生性瘢痕的研究中发现微血管数量减少，认为ALA-PDT可对病灶内血管产生非热源性损伤。Chang等［9］进一步研究发现，体外培养的血管内皮细胞经ALA处理后细胞内PpIX浓度明显升高，并经适当光照后发生凋亡。本实验通过外用ALA结合能量密度为75～200 J/cm2630 nm红光对鸡冠进行干预，肉眼观察发现，干预即刻、7、14、28 d实验区域表现为白色、白紫色、浅白色、鲜红色等反应；干预14、28 d组织学见乳头层毛细血管管径减小、数量减少，血管内皮细胞减少率为33.53%±4.89%～88.96%±2.47%与单纯外用ALA及单纯激光照射组比较，毛细血管减少率均有显著性差异。本研究进一步证实，ALA-PDT对PWS动物模型鸡冠的毛细血管有直接损伤效应。

本实验发现，ALA-PDT对鸡冠的损伤程度随红光能量密度的增大而增强，不同能量密度组之间血管内皮细胞减少率和血管损伤深度的比较差异均有统计学意义，提示ALA-PDT对血管损伤效应与光源的能量密度呈正相关。能量密度不足不能充分激发光敏剂发生光化学反应，但能量密度过高易造成非靶组织的损伤，外用ALA-PDT在能量密度100～150 J/cm2时能对鸡冠产生理想的血管选择性损伤，合适的能量密度范围还有待于进一步的摸索。

近来研究发现PDT还可引起靶细胞凋亡来产生后期治疗效应［10］。本实验也发现鸡冠经ALA-PDT干预出现大量血管内皮细胞凋亡，与单纯外用ALA组和单纯激光照射组比较，差异有统计学意义，并且随红光能量密度增加，ALA-PDT组AI增大、凋亡深度加深。提示血管内皮细胞凋亡的发生是ALAPDT致血管损伤的作用机制之一，且这种作用强度与红光能量密度正相关。

［1］Agostinis P,Berg K,Cengel KA,et al.Photodynamic therapy of cancer:an update［J］.CA Cancer J Clin,2011,61（4）:250-281.

［2］鲁元刚,伍津津,杨宏珍,等.两种光敏剂对鲜红斑痣光动力学疗法的疗效影响［J］.中国激光医学杂志,2008,17（1）:28-31.

［3］Sakamoto FH,Doukas AG,Farinelli WA,et al.Intracutaneous ALA photodynamic therapy：dose-dependent targeting of skin structures［J］.Lasers Surq Med,2011,43（7）:621-631.

［4］Smith TK,Choi B,Ramirez-San-Juan JC,et al.Microvascular blood flow dynamics associated with photodynamic therapy,pulsed dye laser irradiation and combined regimens［J］.Lasers Surg Med,2006,38（5）:532-539.

［5］顾瑛,李峻亨,江亿平,等.光动力疗法选择性治疗鲜红斑痣的机制探讨［J］.中国激光医学杂志,1992,1（3）:141-144.

［6］吴洋,吕春堂,赵晋龙.毛细血管瘤光选择特性及特异治疗光产生的系列研究Ⅲ．鸡冠、肉垂与国人毛细血管瘤医皮肤光吸收特性的比较研究［J］.实用口腔医学杂志,1994,10（4）:282-284.

［7］Smits T,van Laarhoven AI,Staassen A,et al.Induction of protoporphyrin IX by aminolaevulinic acid in actinic keratosis,psoriasis and normal skin: preferential porphyrin enrichment in differentiated cells［J］.Br J Dermatol,2009,160（4）:849-857.

［8］Reid RR,Mogford JE,Butt R,et al.Inhibition of procollagen C-proteinase reduces scar hypertrophy in a rabbit model of cutaneous scarring［J］.Wound Repair Regen,2006,14（2）:138-141.

［9］Chang CJ,Sun CH,Liaw LH,et al.In vitroandin vivophotosensitizing capabilities of 5-ALA versus photofrin in vascular endothelial cells［J］.Lasers Surg Med,1999,24（3）:178-186.

［10］Allison RR,Moghissi K.Oncologic photodynamic therapy:clinical strategies that modulate mechanisms of action［J］.Photodiagnosis Photodyn Ther,2013,10（4）:331-341.

Effects of aminolevulinic acid-based photodynamic therapy on chicken combs,an animal model for port wine stains

Wang Jiao,Huang Xi.Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin 541001,Guangxi,China

ObjectiveTo investigate the effects of aminolevulinic acid-based photodynamic therapy（ALAPDT）on chicken combs,an animal model for port wine stains （PWS）,and to explore the feasibility of PWS treatment with ALA-PDT.MethodsA total of 80 leghorns were randomly and equally divided into 10 groups:blank control group receiving no treatment,ALA group treated with ALA alone,four single laser groups irradiated with 630-nm red laser at 75,100,150 and 200 J/cm2respectively,four ALA-PDT groups pretreated with ALA followed by 630-nm red laser radiation at 75,100,150 and 200 J/cm2respectively.An area sized 1 cm×1 cm were marked at one side of combs in all these leghorns,and served as the experiment area to receive corresponding treatment,with that in the other side as the control area.Tissue specimens were obtained on the 14th and 28th days after treatment followed by the observation of morphological and histological changes,calculation of decrement rate in capillary number,and determination of apoptosis index in vascular endothelial cells （VECs）in chicken combs.ResultsIn all the four ALA-PDT groups,the combs became lighter in color with apoptosis of some VECs as well as a decrease in capillary count and diameter in the dermis of the experiment areas.The decrement rate in capillary number was 33.53%±4.89%,52.02%±2.77%,67.48%±5.58%and 88.96%±2.47%respectively,and apoptosis index in VECs was 63.44±1.09,88.50±6.11,94.32±3.67 and 113.76±10.57 respectively,in the 75-,100-,150-and 200-J/cm2ALA-PDT groups on the 14th day after treatment,and both the decrement rate and apoptosis index in each of these groups were significantly different from those in the blank control group,ALA group,single laser groups receiving red laser radiation at the corresponding dose,and the other ALAPDT groups（allP<0.01）separately.The apoptosis depth of VECs,defined as the vertical distance from the basal layer to the deepest level at which VEC apoptosis occurred,was 201.19 ± 0.33 μm,266.15 ± 1.02 μm,546.09 ± 2.45 μm and 766.37 ± 1.08 μm respectively in the 75-,100-,150-and 200-J/cm2ALA-PDT groups on the 14th day,with significant differences between these four groups （allP<0.01）.Conclusions ALA-PDT can markedly damage capillaries in the animal model of port wine stains,chicken combs,with the degree and depth of capillary damage associated with red light energy density.The induction of VEC apoptosis may be an action mechanism of ALA-PDT in the treatment of PWS.

Port-wine stain;Aminolevulinic acid;Photochemotherapy;Apoptosis;Models,animal;Chicken comb

Huang Xi,Email:706864119@qq.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.05.009

黄熙，Email：706864119@qq.com

2014-07-18）

（本文编辑：吴晓初）