张丽君 王峰 莫俊銮 彭毅

深圳市头孢曲松低敏淋病奈瑟菌株耐药基因分析

张丽君 王峰 莫俊銮 彭毅

目的 了解penA、ponA、porB和mtrR突变与深圳市淋球菌对头孢曲松敏感性降低的相关性。方法 收集2009—2011年深圳市淋球菌临床分离株296株，采用琼脂稀释法筛选出头孢曲松低敏株［MIC（0.06～0.50）μg/ml］53株。将头孢曲松低敏菌株以及按照1∶1抽样原则随机抽取的53株高敏菌株，共计106株淋球菌作为试验菌株。对所有菌株penA、ponA、porB和mtrR基因进行PCR扩增以及DNA测序分析。结果1株淋球菌的青霉素结合蛋白2（penicillin-binding protein 2，PBP2，由penA基因编码）具有镶嵌样结构（MIC 0.125 0 μg/ml），对剩余105株淋球菌PBP2的氨基酸序列分析，共得到16个不同的氨基酸模式。模式ⅩⅢ、ⅩⅧ、ⅩⅩⅩⅧ对应的头孢曲松MIC值相对较高（MIC50均为0.062 5 μg/ml），而模式Ⅱ的头孢曲松MIC值相对较低（MIC50为0.008 0 μg/ml）。mtrR、porB以及ponA突变在头孢曲松低敏组和高敏组中的发生率，差异无统计学意义（均P＞0.05）。结论 PBP2镶嵌样结构可能不是深圳市淋球菌对头孢曲松敏感性降低的主要原因，非镶嵌样PBP2 500～580位多个氨基酸突变产生的不同氨基酸模式联合mtrR、porB以及ponA突变在诱导淋球菌对头孢曲松敏感性降低中可能有意义。

淋病奈瑟球菌；头孢曲松；DNA突变分析；微生物敏感性试验；抗药性，微生物

淋病是我国主要的性传播疾病，据统计，2012年全国淋病发病达91853例，其中广东省以16.77/10万的发病率在全国31个省自治区直辖市中位居第三［1］。头孢曲松作为我国治疗淋病的首选药物之一，临床虽少见治疗失败的病例，但头孢曲松低敏淋球菌菌株的出现，应引起重视。头孢曲松属于β内酰胺类抗生素，具有良好的亲水性，易透过细菌外膜的膜孔，作用于青霉素结合蛋白（penicillin-binding protein，PBP）靶位。淋球菌对头孢曲松耐药主要由染色体介导，多数研究主要关注3个方面：①抗生素作用靶位点的改变，主要是penA基因编码的PBP2以及ponA基因编码的PBP1改变，影响抗生素与淋球菌的结合产生耐药；②porB基因编码细菌细胞膜孔蛋白的改变，导致膜通透性降低产生耐药；③mtrR外排系统的改变，导致细菌外排作用增强产生耐药。我们对2009—2011年淋球菌临床分离株penA、ponA、porB和mtrR基因进行分析，试图了解本市淋球菌对头孢曲松敏感性降低的分子机制。

材料和方法

1.菌株来源：所有淋球菌菌株均来自2009—2011年深圳市淋球菌耐药监测项目。从全市5个区的34家规范化性病实验室中抽取16家作为监测点收集样本,收集时间为每年的7～10月份，收集对象为门诊就诊的疑似淋病患者。样本经革兰染色涂片镜检、Thayer Martin（TM）培养基分离培养纯化、氧化酶试验、糖发酵试验鉴定后洗脱于脱脂牛奶中，-70℃低温保存。

2.药敏试验：所有菌株按照CLSI标准［2］经琼脂稀释法测定头孢曲松的最小抑菌浓度（MIC）。每批试验均由标准菌株（WHO G、WHO L、WHO J、ATCC 49226）作质控。

3.菌株筛选：按照WHO西太平洋区耐药监测指南的解释标准［3］，筛选头孢曲松低敏［MIC（0.06～0.50）μg/ml］淋球菌菌株，按照1∶1抽样原则随机抽取（SPSS 17.0软件）等量高敏（MIC≤0.03 μg/ml）淋球菌菌株，作为试验菌株进行penA、ponA、porB和mtrR基因分析。

4.DNA提取、PCR扩增及测序：采用QIAamp® DNA Mini Kit试剂盒进行DNA提取；由上海英潍捷基贸易有限公司合成引物分别对penA（2 040 bp）［4］、ponA（205 bp）［5］、porB（754 bp）［6］和mtrR（401 bp）［5］基因进行PCR扩增，引物序列见表1。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后送上海英潍捷基贸易有限公司测序。

5.penA、ponA、porB和mtrR氨基酸序列分析：利用MEGA 4软件将序列拼接后与标准株FA 1090的相关基因进行比对分析，分析可能存在的突变位点；同时将PBP2的氨基酸序列与青霉素敏感的淋病奈瑟菌（LM 306）、脑膜炎奈瑟菌（MC 58）、多糖奈瑟菌（NCTC 11858）、灰色奈瑟菌（NCTC 10294）、深黄/干燥奈瑟菌（1654/1659）、灰质奈瑟菌（NCTC8263）的PBP2比较，分析可能存在的镶嵌样结构；利用Cn3D 4.1软件以PBP2晶体结构为基础，分析氨基酸突变［4-6］。

6.统计学分析：采用SPSS17.0软件对实验数据进行分析。对突变位点与淋球菌对头孢曲松敏感性降低的相关性采用χ2检验进行分析，α=0.05。

结果

1.药敏试验结果：共收集296株淋球菌，未发现头孢曲松耐药菌株，头孢曲松低敏菌株有53株，低敏率为17.91%（53/296）。

2.PBP2氨基酸模式分析：106株淋球菌临床分离株的PBP2氨基酸序列分析，共得到17个不同模式。其中，氨基酸模式X具有镶嵌样结构仅包含1株菌株，该株菌的头孢曲松MIC值为0.125 μg/ml。剩余16个非镶嵌样结构模式中，模式ⅩⅧ数量最多为23株，其次为模式ⅩⅢ22株，模式ⅩⅩⅩⅧ13株，模式Ⅱ12株，模式ⅩⅪ10株。总的来说，包含菌株数量较多的氨基酸模式对应的头孢曲松MIC值分布具有多样性，其中模式ⅩⅢ、ⅩⅧ、ⅩⅩⅩⅧ对应的头孢曲松MIC值相对较高（MIC50均为0.062 μg/ml），而模式Ⅱ所含菌株对应的头孢曲松MIC值相对较低（MIC50为0.008 μg/ml）。见表2。

3.PBP2突变位点分析：具有镶嵌样结构的氨基酸模式X与LM 306（基因库编号M32091）相比，共有59个氨基酸位点发生改变，大部分位点位于青霉素转肽酶结构域（81.4%，48/59），其改变了氨基酸片段与多糖奈瑟菌、灰色奈瑟菌、深黄/干燥奈瑟菌PBP2重组后的特异性片段的一致性高达88.1%（52/59）。除氨基酸模式X外，其余16个模式共发现15位氨基酸位点的改变，分别是插入突变345D、 573N，置换突变 A501，F504，A510，A516，H541，G542，V548，P551，P552，K555，I556，I566，A574，其中345 D以及A510V、A516G的发生率均为100%，大部分的氨基酸突变存在于PBP2转肽酶的500～557位氨基酸。MIC值相对较高的三个模式均存在501位点的氨基酸突变，而MIC值相对较低的模式Ⅱ不存在。具有A501突变的78株淋球菌菌株头孢曲松MIC值的分布为（0.002～0.500）μg/ml，随MIC值的增加，其置换率也在上升，3株头孢曲松MIC值为0.5 μg/ml的菌株均具有A501和P551突变。A501突变在头孢曲松低敏株中（82.7%，43/52）和高敏株中（66.0%，35/53）的发生率差异无统计学意义（χ2=3.811，P＞0.05）。而具有H541突变的13株菌头孢曲松MIC值的分布为（0.002～0.250）μg/ml，随MIC值的增加，其突变率在降低，该突变在头孢曲松低敏株中（5.8%，3/52）和高敏株中（18.9%，10/53）的发生率差异有统计学意义（χ2=4.151，P＜0.05）。其他突变位点未观察到类似的趋势变化。见表3。

表2 不同PBP2氨基酸模式菌株对应的头孢曲松最小抑菌浓度（MIC）分布（菌株数）

表3 含不同氨基酸突变位点菌株对应的头孢曲松最小抑菌浓度（MIC）分布（菌株数）

Cn3D 4.1软件对PBP2的晶体结构进行分析，其中A501突变靠近β内酰胺类药物结合区，P551、G542以及H541突变则距离β内酰胺类药物结合区较远。

4.mtrR、porB和ponA突变分析：106株菌的mtrR、porB和ponA突变在头孢曲松低敏株与高敏株中未见明显差异。除1株高敏株外，105株菌ponA基因编码的PBP1均存在L421P突变。99株菌porB基因编码孔蛋白的101和102位点存在非同义置换，在低敏株中，以G101K和A102D最多见（31/53，58.5%），其次为G101D（14/53，8.5%），G101K和A102G（3/53，11.3%），G101K和A102N（3/53，11.3%）。高敏株中分别为G101K和A102D（26/53，58.5%），G101D（16/53，8.5%），G101K和A102G（5/53，11.3%），G101K和A102N（1/53，11.3%）。101和102位点的突变模式在低敏株与高敏株间的发生率差异无统计学意义（均P＞0.05）。

共94株菌在mtrR启动子区的反向重复序列中存在单核苷酸（A）缺失突变，其中低敏株49株（49/ 53，92.5%），高敏株45株（45/53，84.9%）。54株菌在mtrR编码区具有A39T或者G45D突变，其中低敏株 24株（24/53，45.3%），高敏株 30株（30/53，56.6%）。两处突变在低敏株和高敏株中发生率差异无统计学意义（均P＞0.05）。

讨论

penA、mtrR、porB、ponA 4个基因中，关注最多的是penA基因改变引起的PBP2氨基酸序列的改变。PBP2由penA基因（全长1 752 bp）编码，其单体由两个决定域组成，PBP二聚化决定域（71～221残基）和PBP转肽酶决定域（263～557残基）［7］。研究认为PBP2转肽酶决定域的镶嵌样结构［8-9］参与诱导淋球菌对头孢曲松敏感性的降低以及对头孢曲松的高度耐药。但是，我们并未得出相似结论，106株淋球菌PBP2分析仅发现1株菌具有镶嵌样结构（MIC为0.125 μg/ml），该菌的镶嵌样结构是由与多糖奈瑟菌、灰色奈瑟菌、深黄/干燥奈瑟菌以及浅黄奈瑟菌相似的片段组成，其氨基酸模式与日本和澳大利亚之前报道［10-11］的对头孢曲松低敏的菌株的镶嵌样结构模式X的序列一致，并不含有345位点的氨基酸插入，表明其结构并不是由氨基酸插入或置换引起，而由邻近物种浅黄奈瑟菌、灰色奈瑟菌等对青霉素天然耐药的共生细菌将耐药基因部分或全部水平传递给病原菌所形成。由于本次研究仅发现1株菌具有镶嵌样结构，因此我们推测镶嵌样结构并不是导致深圳市淋球菌对头孢曲松敏感性下降的主要原因［12］，PBP2非镶嵌样结构的改变可能具有更重要的意义。值得一提的是，对该菌株的多抗原序列分型（N.gonorrhoeae-multi antigen sequence typing，NG-MAST）结果显示该型别（ST 5308）被香港报道过［13］，考虑到深圳与香港毗邻，人员交往密切以及该株菌对头孢曲松较高的MIC值，也应引起我们的重视。

对剩余105株淋球菌非镶嵌样结构的PBP2进行分析，共发现16个不同的氨基酸模式，包括9个已被报道［7-8］的和7个新发现的，表明深圳市头孢曲松低敏淋球菌菌株的PBP2蛋白存在较高的多样性，这可能与菌株本身具有的高多态性有关。大部分包含菌株数量较多的氨基酸模式对应头孢曲松的MIC值范围较广，仅少量模式与头孢曲松的MIC值相关。主要的6个氨基酸模式ⅩⅧ、ⅩⅢ、ⅩⅩⅩⅧ、ⅩⅪ、Ⅱ、Ⅴ中模式ⅩⅧ、ⅩⅢ对应的头孢曲松MIC值相对较高，而模式Ⅱ的头孢曲松MIC值相对较低，与文献报道相一致［5，10，14］。值得注意的是模式ⅩⅩⅩⅧ为本次研究新发现，对应的头孢曲松MIC值也相对较高。

我们对PBP2相关突变位点（A501V、P551S、G542S及345）以及mtrR、porB、ponA进行分析，发现大部分头孢曲松低敏淋球菌菌株的这些基因均存在与文献报道一致的突变位点［5，14-16］，其中A501V位点的突变率随着菌株MIC值的增加呈上升趋势，在3株头孢曲松MIC值为0.5 μg/ml的菌株中的突变率为100%，且在模式II中不存在。但是该突变位点以及其他的突变位点在两组菌株中所占的比例，差异无统计学意义，因为这些突变位点同时也存在余本研究的高敏株中。我们推测原因可能有以下方面：①WHO西太平洋区耐药监测指南在CLSI标准的基础上增加了淋球菌对头孢曲松敏感性降低折点的判定，即将MIC为（0.06～0.50）μg/ml的淋球菌判定为头孢曲松低敏菌株，目前本地区淋球菌耐药监测显示大部分的菌株对头孢曲松的MIC值都集中在0.06 μg/ml折点附近，这种菌株MIC值的非均匀分布，可能导致分析数据具有一定的偏倚；②mtrR基因编码的是转录阻遏蛋白，其作用是使细菌外排能力增强，而porB基因编码的是淋球菌的外膜孔蛋白，两者均介导的是细菌的非特异性耐药机制，因此，这两个基因的突变可能不是导致淋球菌对头孢曲松敏感性降低的关键因素；③本研究我们只对mtrR、porB、ponA三种基因的部分序列以及penA基因进行了测序分析，可能存在其他位点的突变或其他不确定的耐药基因参与了淋球菌对头孢曲松的敏感性降低。

综上所述，PBP2镶嵌样结构并不是导致深圳地区淋球菌对头孢曲松敏感性降低的主要原因，PBP2模式ⅩⅧ、ⅩⅢ、ⅩⅩⅩⅧ包含菌株对应的头孢曲松的MIC值较高，而模式Ⅱ的头孢曲松MIC值相对较低，推测非镶嵌样PBP2 500～580位多个特定位点氨基酸突变的联合作用可能与淋球菌对头孢曲松敏感性的降低具有一定的相关性，还需要进一步了解深圳地区淋病奈瑟菌对头孢曲松敏感性降低的分子机制。

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Analysis of antibiotic resistance genes inNeisseria gonorrhoeaestrains with decreased sensitivity to ceftriaxone from Shenzhen city

Zhang Lijun,Wang Feng,Mo Junluan,Peng Yi.Clinical Laboratory for Pathogen Detection, Shenzhen Center for Chronic Disease Control,Shenzhen 518020,China
< class="emphasis_italic">Corresponding author:Wang Feng,Email:biowangfeng@163.com

Wang Feng,Email:biowangfeng@163.com

ObjectiveTo analyze the relationship ofpenA,ponA,porBandmtrRgene mutations with the reduced sensitivity to ceftriaxone inN.gonorrhoeaeisolates from Shenzhen city.MethodsA total of 296 clinical isolates ofN.gonorrhoeaewere collected in Shenzhen city from 2009 to 2011.The agar dilution method was used to estimate the sensitivity of theseN.gonorrhoeaeto ceftriaxone.Totally,53 strains with reduced sensitivity to ceftriaxone（minimum inhibitory concentration（MIC）:0.06-0.50 μg/ml）were identified,and 53 strains with high sensitivity to ceftriaxone were randomlyselectedfromtheremainingstrainsandservedasthe controlgroup.PCRwasperformedto amplifythepenA,ponA,porBandmtrRgenes from the 106 isolates followed DNA sequencing.ResultsThe mosaic structure of the penicillinbindingprotein2（PBP2）gene（penAgene）wasfoundinonlyone isolate witha ceftriaxone MICof0.1250 μg/ml.Amino acid sequence analysis of the remaining 105 isolates yielded 16 different amino acid patterns.The MICs of ceftriaxone were relatively high（0.062 5 μg/ml）inN.gonorrhoeaestrains harboring the amino acid patternsⅩⅢ,ⅩⅧorⅩⅩⅩⅧ, but relatively low（0.008 0 μg/ml）in those harboring the amino acid patternⅡ.No significant differences were observed in the frequency ofmtrR,porBor ponA gene mutations betweenN.gonorrhoeaeisolates with reduced sensitivity to ceftriaxone and those with high sensitivity（all P＞0.05）.Conclusions The mosaic structure of PBP2 may be not the primary reason for reduced sensitivity ofNeisseria gonorrhoeaeto ceftriaxone in Shenzhen,while different amino acid patterns produced by various mutations in amino acid residues at positions 500-580 in the non-mosaic PBP2,together withmtrR,porBandponAmutations,may play more important roles in the reduced sensitivity.

Neisseria gonorrhoeae;Ceftriaxone;DNA mutational analysis;Microbial sensitivity tests;Drug resistance,microbial

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.10.006

深圳市卫生计生系统科研项目（201401071）

518020深圳市慢性病防治中心病原检验科

王峰，Email：biowangfeng@163.com

2014-11-10）

（本文编辑：尚淑贤）