刘立新，张羽男，张强，张楠楠

（佳木斯大学药学院，黑龙江省教育厅生物药制剂重点实验室，黑龙江佳木斯154007）

紫花苜蓿多糖的体外抗肿瘤活性研究

刘立新，张羽男，张强，张楠楠

（佳木斯大学药学院，黑龙江省教育厅生物药制剂重点实验室，黑龙江佳木斯154007）

探究超声辅助法提取紫花苜蓿多糖的最佳工艺，并对其进行体外抗肿瘤活性研究。利用超声辅助提取法提取紫花苜蓿多糖；利用细胞活力测定法、LDH活性测定和双荧光染色法研究紫花苜蓿多糖的体外抗肿瘤活性。细胞活力分析仪测定结果显示紫花苜蓿多糖能抑制人乳腺癌细胞的活性；LDH活性测定表明紫花苜蓿多糖能影响人乳腺癌细胞并呈现出剂量-效应关系；双荧光染色法结果表明紫花苜蓿多糖作用后人乳腺癌细胞凋亡数量较对照组增加；紫花苜蓿多糖具有较为良好的体外抗肿瘤活性。

紫花苜蓿；多糖；提取；抗肿瘤活性

紫花苜蓿（Medicago sativaL）是豆科（Leguminosae）苜蓿属（Medicago）的代表性植物。由于其具有储量多、营养价值高和易于消化等特点而一直作为牧草饲料在世界范围内广泛应用［1-2］。现代研究发现紫花苜蓿中含有萜类、多糖及皂苷等多种具有良好抗肿瘤活性成分［3-6］。因此，将价格低廉、产量丰富的紫花苜蓿开发成具有高附加值药用保健食品资源将极具现实意义。植物中多糖的传统提取方法主要是水煎法，但提取效率较低、能耗较大。相比较而言，超声波辅助提取法则具有效率高、能耗小、操作简便等显著优点［7-8］。本文将延续以往的工作［9］，通过研究紫花苜蓿总多糖的超声波辅助提取工艺及其体外抗肿瘤活性，为开发紫花苜蓿中的高附加值成分提供理论参考。

1材料、试剂及仪器

1.1主要材料

原材料：紫花苜蓿，购自北京禾木青科技有限公司。

试剂：DMEM（高糖）培养液、优质胎牛血清购自Gibco公司；胰蛋白酶（Sigma）购自上海化学试剂采购供应站；葡萄糖标准品购自上海楚定分析仪器有限公司；乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、浓硫酸等均分析纯。

1.2主要仪器

FS-20粉碎机：庄河市南甸机械厂；FA2004电子分析天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；KQ-250DE型数控超声清洗器：昆山市超声仪器有限公司；离心机：北京医疗仪器修理厂；HD-136超净工作台：哈尔滨市东联电子仪器有限公司；LX-S50高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；Olympus IX50倒置显微镜：日本奥林巴斯公司；RCO3000TVB型CO2培养箱：美国REVCO公司。

1.3细胞株

人乳腺癌细胞MCF-7。细胞株由佳木斯大学药学院细胞室提供。

2方法

2.1紫花苜蓿多糖的提取

2.1.1原料的预处理

用粉碎机将紫花苜蓿干草粉碎过60目筛，备用。

2.1.2葡萄糖标准曲线的绘制

精密称取葡萄糖标准品10 mg，置25 mL容量瓶中，加水溶解并加至刻度，摇匀，静置，备用。精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分置于具塞试管中，用蒸馏水配制成2 mL溶液，再分别加入1 mL苯酚和5 mL浓硫酸，摇匀，备用。在490 nm的波长处测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线。

2.1.3提取方法

在单因素试验成功的基础上确定以料液比、浸提时间、提取功率和提取温度四因素且每因素三水平进行正交试验设计，试验确定的因素水平见表1。

表1　试验因素水平表Table 1Table of factors and levels

通过测定紫花苜蓿供试品中的多糖的浓度，确定最佳提取工艺条件为提取时间30 min，提取温度70℃，固液比1∶40 g/mL，频率80 Hz。

2.1.4提取物的提取

称取处理好的供试品10.0 g，在优化的最佳提取工艺条件下进行提取。提取后用纱布粗过滤，滤液趁热抽滤。将提取液放在旋转蒸发器中减压浓缩至相同体积后，将滤液静置。待滤液冷却至室温后加入相同体积的乙醇（95%），使混合后的溶液中醇浓度达到80%以上。醇沉48 h后，将混合液通过低速离心机，以3 500 r/min离心15 min，取沉淀干燥后得粗多糖，称量后放入冰箱备用。

2.2紫花苜蓿多糖的纯化和鉴定

用蒸馏水加热溶解粗多糖→sevage法去蛋白5次→上层溶液加2倍体积95%乙醇醇析→沉淀多糖→依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤2次→室温干燥后得纯紫花苜蓿多糖。

将分离纯化得到的多糖纯品配制成5 mg/mL的溶液进行检验。茚三酮反应鉴别是否含氨基酸，或蛋白质等杂质；α-萘酚反应鉴别是否为糖类物质；三氯化铁反应鉴别是否含有酚类物质；碘-碘化钾反应鉴别是否含淀粉类杂质。

2.3样品含量测定

精密吸取0.6 mL多糖纯品置于具塞试管中，用蒸馏水配置成2 mL溶液，再分别加入1 mL苯酚溶液和5 mL浓硫酸，摇匀，静置10 min，然后将具塞试管放入水浴锅中，40℃水浴加热15 min，经流水冷却后。在490 nm的波长处测定吸光度。通过葡萄糖标准曲线的回归方程，求出该样品的葡萄糖浓度（mg/mL）。

结果计算：多糖含量=（C×D）/V×100%

式中：C为供试液葡萄糖浓度，（mg/mL）；D为供试液的稀释因数；V为供试液体积，mL。

2.4体外抗肿瘤活性研究［8］

2.4.1细胞的培养

人乳腺癌细胞MCF-7在5%CO2和37℃的条件下，在含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素的DMEM培养液中贴壁生长。用0.25%胰蛋白酶消化进行传代。

2.4.2细胞活力测定

利用CASY细胞活力分析仪测定细胞活力。调整细胞密度为6×105个/mL接种于12孔培养板中，5% CO2和37℃条件培养24 h，弃去培养液，每孔加入紫花苜蓿多糖使其终浓度分别为25、50、100、200、400 μg/mL，同时设立不加紫花苜蓿多糖的对照组和加100 μg/mL的5-氟尿嘧啶组分别为阴性对照组和阳性对照组，培养24 h后，将12孔板内的细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，取100 μL加入到10 mL CASY-ton缓冲液中稀释摇匀，运行控制面板上的START，进行3次测量体积为400 μL的检测。

2.4.3乳酸脱氢酶（LDH）活性的检测

采用乳酸脱氢酶试剂盒测定：二硝基苯肼比色法。按试剂盒说明书进行操作。

2.4.4吖啶橙-溴化乙锭（AO/EB）双荧光染色法

待细胞在12孔板中培养长成单层后，加紫花苜蓿多糖溶液，使其终浓度分别为100、200、400 μg/mL，同时设立空白对照着组，37℃培养24 h后，用胰酶消化收集细胞，将细胞密度调整为105个/mL，取95 μL细胞悬液加入5 μL AO/EB荧光染色液，混匀，将细胞悬液滴加到载玻片上，加盖玻片后于荧光显微镜下观察计数，每个样品计数200个细胞，根据以下公式计算细胞凋亡指数和细胞坏死指数。

凋亡指数=［凋亡细胞数/（正常细胞数+凋亡细胞数+坏死细胞数）］×100%

3结果与讨论

3.1提取物含量测定结果

3.1.1葡萄糖标准曲线

标准曲线如图1所示。

图1　葡萄糖标准曲线Fig.1Dextrose standard sample

进行线性回归，得回归方程：Y=0.010 4+13.52X，R=0.999 54。

3.1.2紫花苜蓿多糖的含量

在最佳提取工艺条件下，从紫花苜蓿中提取出的多糖含量为15.14 mg/g。

3.2提取物中多糖成分的鉴别结果

3.2.1α-萘酚反应

观察到两层液面出现紫红色环，证明提取物中含有多糖。

3.2.2茚三酮反应

滴加茚三酮溶液，无蓝色出现，说明所获多糖制品不含蛋白质和核酸类物质，非糖蛋白形式。

3.2.3三氯化铁反应和碘-碘化钾反应

结果均呈阴性，说明提取物中不含酚类和淀粉类物质。

3.3体外抗肿瘤结果

3.3.1紫花苜蓿多糖对乳腺癌细胞活力的影响

紫花苜蓿多糖作用24 h后，CASY细胞活力分析仪分析乳腺癌细胞数目及细胞活性，见表2。

表2　紫花苜蓿多糖对乳腺癌细胞活性的影响Table 2The effect of polysaccharides from Medicago sativaL on activities of breast cancer cells

结果表明随着紫花苜蓿多糖浓度的增加，乳腺癌细胞的数目和活性都显著低于阴性对照组。

3.3.2乳酸脱氢酶（LDH）活性检测结果

乳酸脱氢酶（LDH）是存在细胞胞质中的一种非特异性酶，正常情况下多存在于细胞内，当受外来刺激或致伤因素影响后，如细胞膜通透性发生改变或受到损伤时，可大量释放或漏出到细胞外，引起细胞培养上清中LDH活性增强，利用该特点将其作为细胞活性的检测指标，测定有毒物质对细胞的毒性作用。本实验以紫花苜蓿多糖作用乳腺癌细胞24 h后，测定上清液中LDH活性，结果见表3。

表3　紫花苜蓿多糖对乳腺癌细胞LDH活性的影响Table 3The effect of polysaccharides from Medicago sativaL on LDH activity of breast cancer cells

紫花苜蓿多糖能够增加细胞内的LDH漏出率，随着紫花苜蓿多糖浓度的增加，乳腺癌细胞培养上清液中LDH活性增加，试验组与对照组及试验组间比较差异均极显著。

3.3.3吖啶橙-溴化乙锭（AO/EB）双荧光染色结果

图2AO/EB双荧光染色形态学变化
Fig.2The morphological changes of AO/EB fluorescein staining

死的细胞被EB染成红色。见图2。

对照组可见被染成绿色的正常细胞，胞核完整，界限清晰。随着紫花苜蓿多糖浓度的增加，具有细胞膜皱缩、染色体固缩、边聚、碎裂等凋亡典型特征的凋亡细胞数逐渐增多，部分细胞被染成橙红色。

4结论

本研究表明，利用超声辅助提取法可以高效地提取紫花苜蓿总多糖。采用细胞活力分析、LDH活性测定及双荧光染色法研究紫花苜蓿总多糖体外抗肿瘤活性，发现紫花苜蓿多糖能够抑制人乳腺癌细胞的活性并呈现出剂量-效应关系，人乳腺癌细胞的凋亡数量较对照组明显增加，表明紫花苜蓿多糖具有较为良好的抗肿瘤活性。本研究为开发紫花苜蓿中的高附加值抗肿瘤成分提供了一定的理论参考。

［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志:第四十二卷，第二分册［M］.北京:科学出版社，1998:312

［2］洪绂曾.苜蓿科学［M］.北京:中国农业出版社，2009:3

［3］王鑫，马永祥，李娟.紫花苜蓿营养成分及主要生物学特性［J］.草业科学2003，20（10）:39-40

［4］M Magdel-Din Hussein，Wafaa A Helmy，H M Salem.Biological activities of some galactomannans and their suLfated derivatives［J］. Phytochemistry，1998，48（3）:479-484

［5］何云，刘圈炜，王成章，等.紫花苜蓿活性成分研究进展［J］.饲料工业，2005，26（17）:52-54

［6］Gomathi Gandhi GokuLakannan，Karsten Niehaus.Characterization of the Medicago truncatuLa cell wall proteome in cell suspension cuLture upon elicitation and suppression of plant defense［J］.Journal of Plant Physiology，2010，167（18）:1533-1541

［7］蒋珍菊，王周玉.超声波辅助提取女贞子有效成分及其含量分析［J］.时珍国医国药，2010，21（4）:819-821

［8］Martin Tongai Mazvimba，Yu Ying，Cui Zhi-Qin.Optimization and orthogonaldesign of an uLtrasonic-assisted aqueous extraction process for extracting chlorogenic acid from dry tobacco leaves［J］.Chinese Journal of Natural Medicines，2012，10（4）:311-320

［9］张羽男，刘立新，张强，等.紫花苜蓿皂苷抗肿瘤活性研究［J］.时珍国医国药，2013，24（5）:1035-1036

Study on Antitumor Activity of Polysaccharides in Vitro from Medicago sativaL

LIU Li-xin，ZHANG YU-nan，ZHANG Qiang，ZHANG Nan-nan
（School of Pharmacological Sciences，The Key Laboratory for Biological Drug of the Education Department Heilongjiang，Jiamusi University，Jiamusi 154007，Heilongjiang，China）

To discuss the best ultrasonic-assisted extraction condition of the total polysaccharides from Medicago sativaL and to study the antitumor activity in vitro of total polysaccharides from Medicago sativaL. Ultrasonic-assisted extraction was employed in the extraction of the total polysaccharides from Medicago sativaL.Antitumor activity of total polysaccharides from Medicago sativaL was measured by using the cell viability assay，LDH activity and double staining immunofluorescence techniques.Cell viability assay and LDH activity measurement indicated that total polysaccharides from Medicago sativaL can dose-dependently inhibited the proliferation activity of human breast cancer cells.Double staining immunofluorescence techniques showed that human breast cancer cells apparently increased after the treatment of total polysaccharides from Medicago sativaL than the control groups.Total polysaccharides from Medicago sativaL had comparatively obvious antitumor activity in vitro.

Medicago sativaL；polysaccharides；extraction；antitumor activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.001

2014-06-18

国家自然科学基金（No.31101250）；黑龙江省教育厅科学技术研究项目（No.12521560）

刘立新（1978—），女（汉），讲师，在读博士，主要从事天然药物活性成分研究工作。