惠　毅　闫曙光　李京涛

陕西中医药大学(咸阳 712046)



乌梅丸对溃疡性结肠炎大鼠结肠上皮组织MUC2和TFF3的影响*

惠毅闫曙光△李京涛▲

陕西中医药大学(咸阳 712046)

目的：观察乌梅丸对溃疡性结肠炎大鼠结肠杯状细胞分泌MUC2和TFF3蛋白的影响，揭示该方治疗溃疡性结肠炎的作用机制。方法：以SD大鼠为研究对象，采用TNBS/乙醇灌肠诱导大鼠溃疡性结肠炎形成，采用不同剂量的乌梅丸灌胃给药，ELISA和免疫组化法检测结肠上皮组织MUC2、TFF3的含量和表达。结果：乌梅丸能有效提高溃疡性结肠炎大鼠结肠上皮组织MUC2、TFF3的含量，促进其在上皮组织的表达，与模型组比较有统计学意义，各治疗组间比较有显著性差异。结论：乌梅丸有修复溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜屏障的作用，这种作用与剂量成正比关系，其机制可能与促进杯状细胞分泌MUC2和TFF3有关。

肠黏膜屏障分为物理屏障和化学屏障，化学屏障主要由肠道上皮细胞所分泌的黏蛋白、防卫素等多肽抗菌素构成，而杯状细胞能产生和分泌大多数的黏蛋白(MUC2)、大量生物活性分子如上皮膜结合蛋白、三叶因子多肽(TFF3)等[1]。这些物质构成了肠道的黏液层(化学屏障)，在肠道和上皮之间起着重要的防御作。MUC2和TFF3是化学屏障中发挥防卫功能的主要蛋白，通过检测结肠上皮组织MUC2和TFF3的含量以及表达部位的变化，可部分反映肠粘膜屏障的功能[2]。乌梅丸是治疗UC临床疗效确切的方剂，MUC2和TFF3在UC的发病以及治疗中发挥着重要作用[3]。乌梅丸对MUC2和TFF3是否有影响，尚无相关报道，为进一步探讨其治疗UC机制，我们观察了乌梅丸对UC大鼠结肠上皮组织MUC2、TFF3的影响，现报道如下。

1　材　料

1.1实验动物SPF级SD大鼠，雄性，体重220g±20g，西安交通大学医学院实验动物中心提供(合格证号：SCX(陕)2007-001)。

1.2药物和试剂乌梅丸方组成：乌梅、黄连各16g，干姜10g，黄柏、附子、细辛、桂枝、人参各6g，蜀椒、当归各4g。以上药物附子先煎30min，余常规煎煮，高温灭菌后4℃冰箱保存备用。2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)；MUC2、TFF3 EILSA检测试剂盒；MUC2、TFF3抗体。

1.3实验仪器酶标仪：ELX808，美国Bio-Tek公司；超声波细胞粉碎机：JY92-Ⅱ,宁波新芝生物科技公司；图像采集系统：NIKON.ACT-1 DXM1200 日本尼康公司；光学显微镜：蔡司光学仪器(上海)公司。

2　方　法

2.1分组与造模将50只大鼠随机分成5组：空白组、模型组、乌梅丸大、中、小剂量组，每组10只。除空白组外，其余大鼠禁食24h后，采用经肠插管法将50%的TNBS/乙醇溶液按100mg/kg剂量用注射器缓慢推入结肠，诱导溃疡性结肠炎形成。

2.2给药方法造模后8h后开始灌胃给药，各中药治疗组按乌梅丸小剂量组13.3g/(kg·d)，中剂量组26.6g/(kg·d)，大剂量组53.2g/(kg·d)；空白组、模型组均给予生理盐水10mL/(kg·d)，给药10d。

2.3结肠黏膜MUC2、TFF3含量的检测取肛门上约4～6cm间肠段，冰生理盐水清洗，取结肠组织0.5g和生理盐水制成10%匀浆，4000r/min，离心15min，取上清液，按试剂盒说明书检测MUC2、TFF3含量。

2.4结肠黏膜MUC2、TFF3蛋白表达的测定取结肠段，10%中性甲醛液固定24h，梯度酒精脱水，石蜡包埋，4μm切片，脱蜡脱水后，3%双氧水室温孵育10min，蒸馏水冲洗，PBS 浸泡5min，10%山羊血清封闭，室温孵育10min，分别加入MUC2、TFF3一抗4℃过夜，二抗37℃孵育20min，滴加碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育20min，显色剂显色3～15min，冲洗、复染、脱水、透明、封片后采用Zeiss ImergerAl显微镜和DXM1200FCCD图像采集系统观察并采集图像。光镜下阳性反应物为棕黄色颗粒，以图像中最为明显的黄色颗粒为参照，应用图像分析系统Image-Pro Plus5.1测定其积分光密度。

2.5统计学处理采用SPSS18.0处理数据，计量资料采用均数±标准差表示。多组间比较采用One-WAY ANOVA方差分析，两组间比较采用SNK法，以P<0.05为有统计学意义。

3　结　果

3.1ELISA检测结果与空白组比较，模型组大鼠结肠上皮组织MUC2、TFF3含量明显降低(P<0.01)，表明造模后，由于杯状细胞的大量破坏其所分泌的黏蛋白也显著减少，黏膜屏障功能被损坏；与模型组比较，乌梅丸大、中、小剂量大鼠结肠上皮组织MUC2、TFF3含量显著升高(P<0.01)；各治疗组间比较，大剂量组大鼠结肠上皮组织MUC2、TFF3含量最高，其次分别为中、小剂量组(P<0.01)，表明乌梅丸有促进杯状细胞增殖，促进黏蛋白分泌的作用，且这种作用与剂量成正比关系。见表1。

表1　　各组大鼠结肠上皮细胞MUC2、TFF3含量的比较

注：与正常组比较，△P<0.01；与模型组比较，▲P<0.01

3.2免疫组化检测结果与空白组比较，模型组大鼠结肠上皮组织MUC2、TFF3表达明显减弱，阳性细胞分布区域明显减少(P<0.05)；给药后，与模型组比较，乌梅丸大、中、小剂量组MUC2、TFF3表达增强，阳性细胞分布范围增大(P<0.05)，且与剂量呈正比关系，见表2，图1，图2。

表2　肠上皮细胞MUC2、TFF3蛋白积分光密度(IOD)的比较±s)

注：与正常组比较，△P<0.01；与模型组比较，▲P<0.01

4　讨　论

溃疡性结肠炎的主要临床表现之一即黏液脓血便，而杯状细胞是肠道中主要的产黏液细胞，溃疡性结肠炎患者以及各种方法诱导的实验性结肠炎中常可见到杯状细胞的形态学改变。MUC2和TFF3是杯状细胞特异表达的分泌性蛋白。MUC2对肠黏膜有保护作用，一旦MUC2的质和量发生变化，肠黏膜失去保护，导致黏膜屏障受损，通透性增高使肠腔内的抗原、内毒素等促炎症物质进入到黏膜固有层，最终诱发免疫反应，形成肠道炎症。MUC2的这种作用也进一步被基因敲除实验证实，当敲除小鼠的MUC2 基因可诱发自发性结肠炎形成。临床研究表明溃疡性结肠炎患者结肠MUC2表达不但明显减少，而且MUC2的表达与病情活动性(病情轻重、内镜分级、组织学分级)之间有一定关系。三叶因子3(Trefoil factor 3,TFF3)是由杯状细胞分泌的小分子蛋白，是肠道粘液层中的重要组成部分，具有维持粘膜表面的完整性，促进上皮重建，抗凋亡、促分裂、促运动的作用。众多研究发现杯状细胞不仅限于分泌粘液的简单生理功能，而是直接参与了溃疡性结肠炎的发病。因此，恢复杯状细胞数量，促进MUC2和TFF3的分泌，从而恢复黏膜屏障的防御功能可能成为治疗溃疡性结肠炎的有效方法之一[4]。通过本次研究，表明乌梅丸能促进结肠黏膜化学屏障的修复，同时使MUC2、TFF3蛋白表达升高，而这两种蛋白为杯状细胞所分泌，因此，乌梅丸可能通过促进杯状细胞的增殖和分泌，促进结肠黏膜屏障的修复。

[1] Reid G,Carey F A. Pathology of idiopathic inflammatory bowel disease[J].Surgery (Oxford), 2011, 29(8): 362-365.

[2] Noah T K, Donahue B, Shroyer N F.Intestinal development and differentiation[J].Experimental cell research, 2011.317(19): 2702-2710

[3] 闫曙光,惠毅,周永学,等.乌梅丸方加减治疗溃疡性结肠炎的疗效评价与Meta分析[J].中国中医基础医学杂志, 2013 ，19(3): 296-298.

[4] Gersemann M, Stange E F, Wehkamp J. From intestinal stem cells to inflammatory bowel diseases[J]. World journal of gastroenterology: WJG, 2011, 17(27): 3198.

(收稿2015-03-22；修回2015-04-30)

R573.1

Adoi:10.3969/j.issn.1000-7369.2015.09.085

*陕西省科技厅项目(2013JQ4006)

陕西中医学院科研创新基金项目(14XJZR02)

△陕西省胃肠病证方药省级重点研究室(咸阳712046)

▲陕西中医药大学附属医院(咸阳 712046)

主题词 溃疡性结肠炎 乌梅丸 杯状细胞 MUC2 TFF3