胡琳，祖茂衡，华浅近，王丹

血管内皮细胞增殖过程中碘离子与MEK1表达及磷酸化关系的研究

胡琳，祖茂衡，华浅近，王丹

目的研究血管内皮细胞（VEC）增殖过程中碘离子（I-）与丝裂原活化蛋白激酶1（MEK1）表达及其磷酸化的关系，探讨高碘促VEC增殖效应的作用通路。方法①将体外培养的VEC分为空白对照组和不同碘离子浓度的实验组。②采用蛋白质印迹技术（Western blot）检测不同碘离子浓度培养环境中MEK1蛋白表达量及磷酸化水平。结果①在300 μg/L碘离子浓度组，MEK1蛋白相对表达量高于其他组（P＜0.05）。②500 μg/L、1 000 μg/L碘离子浓度可促进MEK1（Ser298位点）磷酸化水平上调（P＜0.05）。③各实验组MEK1（Thr286位点）磷酸化水平下调（P＜0.05）。结论碘促VEC增殖可能与胞外信号调节激酶（ERK）通路的激活有关。

布加综合征；血管内皮细胞；碘离子

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between iodine ion and the expression of both MEK1 and its phosphorylation during the course of vascular endothelial cell（VEC）proliferation，and to explore the pathway of the promoting effect of iodine ion on VEC proliferation.Methods①The vascular endothelial cells cultured in vitro were divided into the control group（without any treatment）and four KI groups（treated with 100 μg/L KI，300 μg/L KI，500 μg/L K and 1 000 μg/L KI，respectively）.②The effects of iodine ion concentration（100 μg/L，300 μg/L，500 μg/L and 1 000 μg/L，respectively）on the expression of MEK1 and its phosphorylation were determined using Western Blot method.Results①The expression of MEK1 in 300 μg/L KI group was higher than that in other groups（P＜0.05）.②The MEK1 phosphorylation levels at Ser298 site in iodine ion concentration of 500 μg/L and 1 000 μg/L groups were significantly increased（P＜0.05）.③The MEK1 phosphorylation levels at Thr286 site in all different iodine ion concentration groups were significantly decreased（P＜0.05）.ConclusionThe promotion effect of iodine ion on vascular endothelial cell proliferation is related to the activation of extracellular signal-regulated kinase（ERK）signal transduction.（J Intervent Radiol，2015，24：150-153）

【Key words】Budd-Chiari syndrome；vascular endothelial cell；iodine ion

我国布加综合征（Budd-Chiari syndrome，BCS）以下腔静脉隔膜阻塞型（membranous obstruction ofthe inferior vene cava，MOVC）为主，其特征是下腔静脉和（或）肝静脉开口处隔膜形成。病理学研究发现隔膜组织主要由血管内皮和纤维组织构成［1-2］。同时流行病学研究显示该型患者分布与水源性高碘地区分布相符［3］。针对碘离子（I-）与血管内皮细胞（VEC）增殖的关系，研究显示碘不促进VEC合成血管内皮生长因子（VEGF）［4］，且高碘环境未诱导VEGF受体（VEGFR）与VEC增殖有关的位点磷酸化改变［5］。但细胞增殖检测显示碘促VEC增殖可能与MEK1激活有关［6］，提示高碘促VEC增殖效应可能发生于细胞质。

本研究在体外用不同浓度I-培养VEC，检测MEK1的表达及调控增殖相关位点Ser298、Thr286的磷酸化水平，探讨高碘促VEC增殖效应的作用通路。

1　材料与方法

1.1细胞株培养

EA.hy926人脐静脉内皮细胞融合细胞（目录号GNHu39）购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。细胞培养于Corning培养皿中，使用DMEM高糖培养基（GIBCO公司），加10%胎牛血清（GIBCO公司），置于37℃、5%CO2条件的培养箱中培养，至细胞贴壁生长汇合即可传代。

1.2检测方法

Western blot检测丝裂原活化蛋白激酶1（MEK1）蛋白表达及磷酸化：取对数生长期内皮细胞1∶5传代，常规培养至70%细胞汇合，再以不加血清的DMEM培养基饥饿培养24 h。随后根据加入浓度不同I-，将细胞分5组：①空白对照组，直接使用DMEM培养基培养；②高碘组，向DMEM培养基中分别加入碘化钾，使I-终浓度分别为100、300、500和1 000 μg/L。再将细胞于培养箱中孵育12 h。用冰PBS洗涤3次，每个皿中加入80 μl含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液提取细胞总蛋白，使用BCA法测蛋白浓度并分装。取等量样品加入上样缓冲液煮沸5 min后上样、电泳、转膜和免疫反应。MEK1、p-MEK1（Ser298）、p-MEK1（Thr286）一抗均以1∶1 000稀释，二抗稀释比亦为1∶1 000。显色方法为5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/氯化硝基四氮唑蓝（BCIP/NBT）发色显色法。以上条带均以β-actin作为内参照。扫描后采用IPP6.0图像分析软件对特异性条带进行半定量分析，以MEK1、p-MEK1（Ser298）、p-MEK1（Thr286）各自与β-acting的灰度值的比值评定MEK1及p-MEK1（Ser298、Thr298）蛋白表达水平。以上实验重复3次。

1.3统计学方法

用SPSS16.0软件行统计分析，计量数据结果以均数±标准差（±s）表示。两组之间比较采用独立样本t检验，多组之间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），多组之间两两比较采用LSD法或Tamhane's T2法。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1I-对MEK1蛋白表达的影响

各碘浓度组与空白组比较，300 μg/L组MEK1蛋白相对表达量较空白对照组明显提高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1、图1。

表1　不同浓度碘环境中MEK1总蛋白及Ser298、Thr286位点磷酸化蛋白的表达

图1　MEK1、p-MEK1（Ser298）、p-MEK1（Thr286）在各组中的表达

2.2I-对Ser298位点磷酸化的影响

与空白对照组比较，500 μg/L组和1 000 μg/L组的MEK1（Ser298）蛋白磷酸化水平上调（P＜0.05），500 μg/L组和1 000 μg/L组的组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3I-对Thr286位点磷酸化的影响

各离子组与空白对照组比较，MEK1（Thr286）蛋白磷酸化水平下调（P＜0.05）；碘浓度300 μg/L组、500 μg/L组、1 000 μg/L组与100 μg/L组比较，磷酸化水平下调（P＜0.05）；300 μg/L组、500 μg/L组、1 000 μg/L组组间两两比较，仅500μg/L组较300 μg/L组磷酸化水平下调，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3　讨论

3.1I-与VEC增殖作用及增殖途径的探讨

与国外不同，我国BCS患者以MOVC型多见，隔膜由不含弹性蛋白的纤维组织表面覆盖内皮细胞构成［7］，并与下腔静脉管壁相延续［1］。国内流行病学调查显示MOVC型患者分布与水源性高碘地区分布相符，患者尿碘水平亦高于正常人［3］。目前研究显示患者血清中碘含量明显高于正常人（未发表资料）。在体外培养VEC发现一定浓度的I-能够促进其增殖［8-9］，我们认为I-可能是引起下腔静脉隔膜形成的重要因素之一。

我们的前期研究发现MOVC型BCS患者下腔静脉血中VEGF含量明显高于非BCS对照组［10］，但体外高碘培养的VEC并未出现VEGF的高表达［4］，且I-对细胞膜受体VEGFR-2的总表达量无影响，同时介导细胞增殖的VEGFR-2 Tyr1175位点的磷酸化水平未出现上调［5］，提示I-促VEC增殖效应不依赖于VEGF和VEGFR的高表达。VEC增殖检测发现I-促增殖效应可能与MEK1的激活有关［6］，以此为切入点，我们推测I-可能直接作用于细胞质，激活ERK通路引起细胞增殖效应。

ERK是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族的一员，是调节细胞生长、发育及分裂的信号网络的枢纽。Ras/Raf-1/ MEK1/ERK1/2是ERK通路的主要途径［11］，Raf-1是MAPK级联反应的启动蛋白，一旦被上游蛋白Ras激活，可与MEK1结合并使之磷酸化，活化的MEK1连接并激活ERKs，ERKs进入细胞核，直接激活大量的转录因子［12］，发挥细胞增殖效应。

3.2I-与MEK1、p-MEK1（Ser298、Thr286）蛋白表达的关系及意义

MEK1是调控ERK通路级联反应的核心，300 μg/L组的MEK1蛋白高表达，提示I-可能通过提高MEK1的蛋白表达量来发挥VEC增殖效应。其激活是通过磷酸化实现的，MEK1存在多个磷酸化位点，其中两个重要位点Ser298和Thr286的磷酸化对MEK1活性的影响截然不同，并对随后的酶促级联反应有不同的调控作用。

本研究的Western blot结果显示，I-浓度500 μg/ L组和1 000 μg/L组较对照组的Ser298位点磷酸化水平明显上调，提示高浓度I-能让Ser298位点的磷酸化水平上调。碘对体外培养的VEC有刺激增殖的作用，这种作用与I-浓度及作用时间有关，高浓度I-组细胞数量及细胞活性明显升高所需的作用时间短于低浓度I-组，低浓度I-组需延长作用时间才显示出细胞数量及活性的明显升高［9］，高碘对VEC的作用呈现出剂量-时间-效应关系。鉴于本实验中I-作用12 h后即提取各组蛋白以备用，我们推测100和300 μg/L组在延长培养时间后Ser298的磷酸化水平也较对照组上调。位点Ser298位于MEK1第Ⅸ至Ⅹ催化区之间的多聚脯氨基序列中，Ser298的磷酸化可最大化Raf-1和MEK1的结合作用，并增强MEK1的活化［13］。活化的MEK1通过其N端区域与ERKs直接连接，催化ERK的亚功能区8“TEY盒”中的Tyr和Thr残基双特异性磷酸化，激活ERK，随后发挥细胞增殖效应。MEK1不仅仅是ERK的激活物，还可能是ERK在胞质中的锚定器，当信号通路无活性时，它将ERK固定在胞质中，一旦有信号刺激ERKs磷酸化及二聚体化，可激活ERKs并将其转移到胞核或其他活化位点，再进一步磷酸化下游底物。

与对照组比较，各实验组Thr286磷酸化水平下调；与100 μg/L组比较，300、500和1 000 μg/L组Thr286磷酸化水平下调；500 μg/L组较300 μg/L组Thr286磷酸化水平下调。Thr286的磷酸化直接灭活MEK1［14］，引起随后MEK1和ERK的解偶联［15］，从而使MAPK级联反应终止。所以在细胞周期中，Thr286可能是终止细胞有丝分裂的调控点［14］。本研究中，各实验组较对照组的差异及实验组组间的差异提示I-可引起MEK1（Thr286）磷酸化水平的下调，并且在一定浓度范围内，随着I-浓度的增高，ERK通路的负向调控作用逐渐减弱。

综上所述，本研究通过I-促VEC增殖的作用通路，探讨MOVC型BCS的可能发病机制，本研究中发现不同浓度I-可以促进MEK1蛋白高表达及MEK1（Ser298、Thr286）的磷酸化水平改变，提示I-促VEC增殖效应最终是通过ERK通路的激活来实现的。但本研究不能确定I-是否直接作用于MEK1，且100 μg/L组与300 μg/L组延长I-培养细胞时间是否能上调Ser298位点的磷酸化水平需跟进观察。作为MAPK家族成员，ERK通路与其他的细胞内信息传递通路相互联系和作用，是调节细胞生长、发育及分裂的信息网络的中枢，其各级酶促级联反应易受其他通路及各种细胞因子的调控，I-促VEC增殖效应是否经其他通路激活ERK通路也有待进一步研究。

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The relationship between iodine ion and the expression of both MEK1 and its phosphorylation duringthe course of vascular endothelial cell proliferation

HU Lin，ZU Mao-heng，HUA Qian-jin，WANG Dan.Department of Interventional Radiology，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu Province 221002，China

ZU Mao-heng，E-mail：cjr.zumaoheng@vip.163.com

R543.5

A

1008-794X（2015）-02-0150-04

2014-07-09）

（本文编辑：李欣）

10.3969/j.issn.1008-794X.2015.02.015

江苏省科技创新与成果转化专项基金资助项目（BL2012021）

221002江苏徐州徐州医学院附属医院介入放射科

祖茂衡E-mail：cjr.zumaoheng@vip.163.com