王春明钟超王凤学黄凡贾红华韦萍赵印

（1.南京工业大学生物与制药工程学院，南京 211816；2.河南天冠企业集团有限公司车用生物燃料技术国家重点实验室，南阳 473000）

一株Bacillus sublitis JH-1发酵产木聚糖酶培养基的响应面优化

王春明1钟超1王凤学1黄凡1贾红华1韦萍1赵印2

（1.南京工业大学生物与制药工程学院，南京 211816；2.河南天冠企业集团有限公司车用生物燃料技术国家重点实验室，南阳 473000）

利用刚果红透明圈法从秸秆堆肥中筛选出一株产木聚糖酶菌株Bacillus sublitis JH-1，以单因素试验为基础，采用响应面试验设计对Bacillus sublitis JH-1液态发酵产木聚糖酶的培养基进行了优化，得到产木聚糖酶发酵最适条件为：培养温度33℃，pH值6.0，麦芽糖浓度为2.6%，酵母粉浓度为1.2%，KH2PO4浓度为1.2%，发酵产酶量比优化前提高了1.8 倍。

Bacillus sublitis JH-1；木聚糖酶；响应面法

木聚糖酶（1，4-β-D-xylanase）是一种糖基水解酶，以内切方式作用于木聚糖主链内部的β-1，4-木糖苷键，其主要水解产物为低聚木糖和少量木糖。木聚糖酶主要存在于海洋陆地动物、植物和微生物之中，但其主要来源出自微生物。产木聚糖酶的微生物种类很多［1］，近年来报道的有曲霉［2］、木霉［3］、青霉［4］、链霉菌、酵母菌［5］等真菌属和芽孢杆菌［6］等细菌属［7］。

目前，木聚糖酶已被广泛应用于人们的生产生活中［8-11］。木聚糖酶可以辅助漂白，改善造纸传统工艺中剧毒致癌的含氯漂白剂［12］。木聚糖还可用于饲料、酿酒、面粉、果汁澄清等行业。国外早在20世纪中叶就开始对木聚糖酶进行研究，我国到20世纪80年代才开始涉足该领域［13］，最初仅应用于工业化饲料生产中，但随着科学技术的发展，在纺织、造纸、废纸脱墨等行业中都有广泛的应用，工业化生产木聚糖酶的报道也越来越多［14］。近些年，因木聚糖酶可将废弃的生物质材料转化为乙醇、燃料等能源，由于其巨大的潜力和经济价值，使得越来越多的学者投入到对它的研究中［16］。

由于木聚糖酶广泛的应用领域及巨大经济潜力，筛选优化木聚糖酶高产菌株具有重要的研究意义和应用价值。自然界中很多微生物都能产生木聚糖酶，针对废弃农作物中半纤维素组分的高效利用，本研究前期以此筛选到了一株产木聚糖酶的菌株，通过PCR提取16S rDNA进行测序分析，测序结果通过GenBank Blast分析，认定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），命名为B. sublitis JH-1。因其产生芽孢能耐受高温高压，与真菌、放线菌和霉菌的传统固态培养相比，液态培养具有生产效率高、容易自动化控制、可对过程进行多种手段精确调控的优势，且具有较好的稳定性和生物活性，并容易分离。

本研究应用的菌株属于嗜酸性微生物，因此可以考虑将其应用于饲料加工方面。向家畜养殖的饲料中添加木聚糖酶，能有效提高动物消化中的酶活性，促进营养物质有效的消化吸收。此外，被降解后的木聚糖，转化为低聚木糖能使双歧杆菌增殖，有效地调节动物肠胃中的微生态环境，达到提高动物的抗病及生产性能的效果。王修启等［15］验证了在家畜饲料中添加木聚糖酶，可有效提高家畜的生产性能。

由于B. sublitis JH-1具有良好的发展前景，但微生物生长受培养条件和培养基成分影响很大，为了优化其生长环境，本研究在对该菌株木聚糖酶发酵条件进行单因素优化的基础上，通过Plackett-Burman（PB）试验设计、最陡爬坡试验设计和Box-Behnken试验设计3个过程，得出影响显著的因子和水平，通过建立回归拟合方程得出理论最高值，对培养基组分进行进一步优化，旨在更好地提高该菌株的产酶量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 木聚糖酶高产菌株筛选样品来源于南京工业大学沼气站秸秆堆肥区。

1.1.2 培养基 发酵培养基（%）：蛋白胨1.0，酵母粉0.5，NaCl 1.0，121℃高压灭菌20 min。

1 mg/mL刚果红溶液：称取1 g刚果红溶于1 000 mL去离子水中，121℃高压灭菌20 min。

1%木糖标准溶液：准确称取1 g木聚糖溶解后定容至 100 mL，贮存4℃备用。

3，5-二硝基水杨酸显色液：准确称取 6.3 g 3，5-二硝基水杨酸置于262 mL 2 mol/L 氢氧化钠溶液中，然后加酒石酸钾钠的热溶液 500 mL（182.0 g酒石酸钾钠溶于500 mL蒸馏水中），再加 5.0 g重蒸酚和5.0 g亚硫酸钠，搅拌至溶解，冷却后定容至1 000 mL，贮于棕色瓶中置冰箱一周后使用，用前过滤。

1.2 方法

1.2.1 酶活力测定方法 采用DNS法［17］测定酶反应体系中产生的还原糖，以木糖作标准曲线测定木聚糖酶的活性。

酶活力单位的定义：以木聚糖作为底物，每毫升稀释酶液每分钟释放1 μg还原糖所需的酶量为一个酶活单位。

1.2.2 单因素试验

1.2.2.1 温度对产木聚糖酶的影响 将B. sublitis JH-1接入液态发酵培养基中，置于31℃-39℃ 180 r/min摇床培养箱中培养3 d后，测定酶活，并根据酶活力的大小，确定最佳的培养温度。

1.2.2.2 初始pH对产木聚糖酶的影响 分别配制0.2 mol/L的pH4.0和pH5.0的醋酸缓冲液、pH6.0-9.0磷酸盐缓冲液、pH9.0 Tris盐酸缓冲液，分别添加液态发酵培养基中。将B. sublitis JH-1接入液态发酵培养基中，置于180 r/min摇床培养箱中33℃培养3 d后，测定酶活，并根据酶活力的大小，确定最佳的初始pH。

1.2.2.3 碳源对产木聚糖酶的影响 在液态发酵培养基中，分别添加浓度为1%（m /w）的木糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木聚糖、玉米芯，可溶性淀粉，将B. sublitis JH-1接入pH6的液态发酵培养基中，置于180 r/min摇床培养箱中33℃培养3 d后，测定酶活，并根据酶活力的大小，确定最佳的碳源种类。

根据碳源的筛选结果，选择酶活力最高的作为最适碳源，在pH6.0的液态发酵培养基中，分别添加0.5%-4%的麦芽糖，置于180 r/min摇床培养箱中33℃培养3 d后，测定酶活，并根据酶活力的大小，确定最佳碳源添加量。

1.2.2.4 氮源对产酶的影响 在已优化的pH、碳源的液态发酵培养基中，分别添加浓度为0.4%（m/w）的无机氮源NaNO3、KNO3、NH4Cl、（NH4）2SO4，有机氮源尿素、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉作为单一氮源，将B. sublitis JH-1接入，置于180 r/min摇床培养箱中33℃培养3 d后，测定酶活，并根据酶活力的大小，确定最佳的氮源种类。

根据氮源的筛选结果，选择酶活力最高的作为最适碳源，分别添加0.5%-4%的酵母粉，置于180 r/min摇床培养箱中33℃培养3 d后，测定酶活，并根据酶活力的大小，确定最佳氮源添加量。

1.2.3 响应面优化设计

1.2.3.1 PB试验-显著影响因素的筛选 在单因素摇瓶发酵试验的基础上，以下试验都采用100 mL摇瓶，10%的接种量，90 r/min转速33℃摇床培养2 d的方式（试验得出的结论，篇幅有限，未在文中列出），将筛选出的影响B. sublitis JH-1产木聚糖酶发酵培养基的9种成分，乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨、氯化钠、硫酸镁、硫酸铵和磷酸二氢钾分别作为PB试验的考察对象，利用Minitab 16软件，选用N=12的 Plackett-Burman设计，并余2个空项作为误差分析。

表1 Plackett-Burman试验因素水平及编码

1.2.3.2 最陡爬坡试验 根据PB试验结果，确定影响B. sublitis JH-1木聚糖酶的3个主要因素，根据PB试验得到的一次拟合方程系数的正负决定该因素的爬坡方向和步长的递增和递减。

1.2.3.3 中心组合试验及响应面分析 根据最陡爬坡试验的结果，选用麦芽糖、酵母粉、磷酸二氢钾为考察因素，采用Box-Behnken中心组合试验设计，设计3因素3水平的响应面分析（RSA）试验，试验因子和编码水平，见表2。

表2 试验因素水平及编码水平

2 结果

2.1 培养温度、初始pH对产木聚糖酶的影响

如图1所示，随着温度的上升产酶量增加，但当温度高于33℃时，产酶量明显下降。结果显示，在33℃下，B. sublitis JH-1产木聚糖酶量最大。

图1 温度对产木聚糖酶的影响

如图2所示，pH＞7时，B. sublitis JH-1产酶活性较低，说明枯B. sublitis JH-1适合偏酸性环境，中性或者偏碱都不适合B. sublitis JH-1的生长和代谢，pH值为6时，B. sublitis JH-1产酶活性最强。

2.2 碳源对产木聚糖酶的影响

如图3所示，以麦芽糖作为碳源，对B. sublitis JH-1产酶更有利。

通过研究不同麦芽糖添加量对B. sublitis JH-1产木聚糖酶的影响，结果（图4）显示，其产酶效果依次为1.5%＞2%＞2.5%＞1%，可见添加1%-2.5%的麦芽糖作为碳源，产酶效果较好，最佳添加量为1.5%。

图2 pH对产木聚糖酶的影响

图3 碳源对产木聚糖酶的影响

图4 麦芽糖浓度对产木聚糖酶的影响

2.3 氮源对产木聚糖酶的影响

如图5所示，分别添加浓度为0.4%的不同氮源，考察他们对B. sublitis JH-1产木聚糖酶的影响，结果发现以酵母粉为氮源，优于其他无机氮源和有机氮源。分别添加0.5%-4%酵母粉考察不同浓度酵母粉对B. sublitis JH-1酶活的影响。如图6所示，1%-2%的酵母粉作为氮源产酶效果较好，最佳含量为1.5%。

图5 氮源对产木聚糖酶的影响

图6 酵母粉浓度对产木聚糖酶的影响

2.4 Plackett-Burman设计筛选及影响产木聚糖酶的重要因素

PB试验设计及结果见表3，由表4 的结果得到图 7的效应 Pareto 图。结果显示，只有麦芽糖、酵母粉和磷酸二氢钾超过了误差边界。因此，麦芽糖、酵母粉和磷酸二氢钾是影响B. sublitis JH-1影响木聚糖酶的培养基重要因素。同时由表4结果发现，麦芽糖、酵母粉和磷酸二氢钾的效应分别为（+）148.41、（-）106.13和（+）74.83。

表3 Plackett-Burman试验设计及结果

表4 PB设计结果的各因素效应及评价

图7 影响木聚糖酶发酵的 9 成分的 Pareto 图

2.5 最陡爬坡试验

最陡爬坡试验的设计及结果（表5）显示，实验 5对应的木聚糖酶酶活为2 821.19 U/mL，随后木聚糖酶开始降低，因此选取实验5 的麦芽糖（2.4%）、酵母粉（1.2%）和磷酸二氢钾（1.2%）做优化试验的中心点。

表5 最陡爬坡试验设计及其结果

2.6 中心组合试验及响应面分析

利用统计软件Design-Expert7.1.1 对试验进行设计和数据分析，根据表6的试验结果，对表中数据进行多元回归拟合，所得到的木聚糖酶酶活（Y）对麦芽糖（X1）、酵母粉（X2）和KH2PO4（X3）通过拟合可得到的二次多项式方程为：Y=3670.84+92.63X1-10.31X2+44.52X3-6.01X1X2-4.01X1X3-76.45X2X3-104.28X1X1-133.20 X2X2-106.57 X3X3，由此方程可进行方差分析，结果见表7。

表7显示，建立的回归模型显著（P＜0.05），说明方程拟合度较好；Pr失拟项= 0.，1126＞0.05，说明失拟项并不显著，残差由于随机误差而引起，模型选择正确；复相关系数R2=0.976 7，表明预测值与实测值之间具有比较高的相关性；调整性决定系数表明方程模型可信度比较高，能够较好地描述本次试验的结果。

表6 中心组合试验设计及结果

图8 麦芽糖和酵母粉对木聚糖酶酶活影响的响应面立体分析图

图9 麦芽糖和磷酸二氢钾对木聚糖酶酶活影响的响应面立体分析图

图10 酵母粉和磷酸二氢钾对木聚糖酶酶活影响的响应面立体分析图

由回归方程所作出的响应面立体分析图（图8-图10）显示，它们分别反映了麦芽糖（X1）、酵母粉（X2）和KH2PO4（X3）这3个因素之间两两交互作用对响应值的影响。麦芽糖和酵母粉对木聚糖酶的影响如图8所示，X1因素（麦芽糖）与X2因素（酵母粉）交互作用显著，X1因素（麦芽糖）对木聚糖酶酶活的影响较大，为主效应因子。如图9所示，X1因素（麦芽糖）与X3因素（KH2PO4），当KH2PO4的浓度一定时，木聚糖酶的酶活随着麦芽糖添加浓度的增加而增大，但当麦芽糖的添加浓度大于2.577%时，木聚糖酶酶活逐渐呈下降趋势；当麦芽糖的添加浓度一定时，随KH2PO4添加浓度的增加，木聚糖酶的酶活先增加后降低。如图10所示，酵母粉和KH2PO4的浓度一定时，另一因素的浓度增加到达最适浓度时，木聚糖酶酶活随之增大，浓度超过最适浓度后继续增加，木聚糖酶酶活随之降低。

从响应面图可分析得出，对于各因素之间的交互影响中，3个因素中麦芽糖对木聚糖酶酶活影响最大，KH2PO4次之，酵母粉最弱。通过Design-Expert软件分析，可得到B. sublitis JH-1液态发酵产木聚糖酶，最佳培养基配方为：麦芽糖添加浓度为2.577%，酵母粉添加浓度为1.176%，KH2PO4添加浓度为1.248%，在此条件下木聚糖酶酶活预测值可达3 697.37 U/mL。结合实际试验操作的方便性和方差分析的结果，将最终确定培养基配方为：麦芽糖添加浓度为2.6%，酵母粉添加浓度为1.2%，KH2PO4添加浓度为1.2%。为了验证B. sublitis JH-1液态发酵产木聚糖酶响应面模型的精确性，对该模型进行试验验证，按照最终确定的培养基参数进行3次重复试验验证，可得木聚糖酶酶活平均值为3 693.91 U/mL，表明此模型实际值与预测值有较好的拟合性，是可行有效的，具有较高的实践参考价值。

3 讨论

本研究中，培养条件对微生物生长影响很大，温度越高，微生物生长代谢越快，次级代谢产物的合成速度也加快。但由于有些中间代谢酶类对温度变化比较敏感，过高的温度反而会降低其活性，从而影响相关代谢产物的积累。初始pH的变化会直接影响微生物细胞膜的电荷状态，从而影响微生物的生理代谢功能。

培养基成分是影响微生物生理代谢的最重要因素，直接关系到酶等次级代谢产物的产生和积累，对碳源、氮源等培养基成分进行优化，不仅可以降低成本，更充分发挥菌株产酶潜能，提高产酶率。推测菌体不仅可利用麦芽糖作为生长代谢的来源，乳糖也可能是木聚糖酶合成的较强的诱导物，麦芽糖含量过低不能达到好的诱导效果，过量则可能反过来抑制B. sublitis JH-1的生长及产酶。陈熊等［18］报道通过添加不同的碳源，特别是麦芽糖，可显著提高微生物木聚糖酶产量，张云雁等［19］也报道麦芽糖对木聚糖酶表达具有诱导作用，与本研究结果一致。氮是微生物生长代谢的关键元素，也是各种生物活性物质的重要组成部分。其原因可能是酵母粉不仅为B. sublitis JH-1生长提供了氮源，满足生长代谢的需求，还能提供辅助的生长因子及丰富的氨基酸促进其代谢产物的合成。江国忠等［20］也报道添加酵母粉为氮源培养B. sublitis JH-1，酶活力显著高于其他氮源。

本研究筛选的B. sublitis JH-1还可通过离子束诱变育种技术、蛋白质工程、基因工程，固定化细胞技术［21］等技术手段，进一步提高B. sublitis JH-1的木聚糖酶产量，研究其酶学性质，充分挖掘其应用潜力。

4 结论

对B. sublitis JH-1木聚糖酶产量有显著影响的3个因素为麦芽糖、酵母粉和KH2PO4；在此最优培养基条件下，该菌株木聚糖酶产量可达到3 693.91 U/mL，发酵产酶量比优化前提高了1.8倍。用响应面法优化B. sublitis JH-1产木聚糖酶的发酵培养基是有效可行的。

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（责任编辑 马鑫）

Optimization of Bacillus sublitis JH-1 for Xylanase Production by Response Surface Analysis

Wang Chunming1Zhong Chao1Wang Fengxue1Huang Fan1Jia Honghua1Wei Ping1Zhao Yin2
（1. Colloge of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816；2. State Key Laboratory of Motor Vehicle Biofuel Biotechnology，Henan Tianguan Group Co. Ltd.，Nanyang 473000）

Xylanase producing strain Bacillus sublitis JH-1 was screened from straw compost by Congo red transparent circle method. According to the single-factor experiments， response surface methodology was applied to optimize the liquid state fermentation conditions of Bacillus sublitis JH-1 for xylanase production， with the optimal conditions being listed as follows：temperature as 33℃， pH value as 6.0， maltose as 2.6%（m/V）， YE as 1.2%（m/V）， KH2PO4as 1.2%（m/V）. Increased 1.8 times in average as compared with preliminary culture and consistent with the maxmum predicted value.

Bacillus sublitis JH-1；xylanase；Response Surface Methodology

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.027

2014-07-01

国家“863”计划（2012AA021405），车用生物燃料技术国家重点实验室开放课题（2013024），广西科学研究与技术开发计划（桂科重1348004-4）

王春明，女，硕士研究生，研究方向：生物能源；E-mail：aishuiyuasy@sina.com

贾红华，男，副研究员，研究方向：生物能源；E-mail：hhjia@njtech.edu.cn