王凤军刘莎莎冯俊丽

（1.库尔勒出入境检验检疫局，库尔勒 841000；2.浙江理工大学生物工程研究所，杭州 310018）

实时荧光定量PCR快速检测四种蛀果性害虫

王凤军1刘莎莎2冯俊丽2

（1.库尔勒出入境检验检疫局，库尔勒 841000；2.浙江理工大学生物工程研究所，杭州 310018）

苹果蠹蛾、香梨优斑螟、梨小食心虫及地老虎是危害新疆香梨等产品的重要害虫，前3种也属于国际上检验检疫重要虫害。目前，国内主要依靠虫体的形态特征对其进行鉴定，缺少分子生物学检测手段，这限制了我国香梨等产品的生产和出口贸易发展。首先得到这4种害虫的16S rDNA COI基因片段，在差异序列设计特异性的引物和探针，利用实时荧光定量PCR技术建立快速分子检测试验体系，依据标准曲线分析检测体系的重复性和灵敏性。结果表明，苹果蠹蛾、香梨优斑螟、梨小食心虫及地老虎最低检出限分别在1.605×10-2、0.729×10-2、0.475×10-2和0.818×10-2ng/μL，满足检验检疫日常检测需求。为克服实际检测过程中经常会出现某一虫的残片样本或者几种虫聚集在一起的混合样本，使用了单头、多头DNA样本及4种害虫的混合DNA样本进行检测分析，进一步验证了该方法的特异性，可靠性和可适用性。

苹果蠹蛾；香梨优斑螟；梨小食心虫；地老虎；实时荧光定量PCR

库尔勒香梨是新疆巴州特色优质水果，已有1 400多年的栽培历史，现种植面积约4.667×104hm2，作为新疆唯一获准进入北美等高端市场的水果，已出口至东南亚、美洲、澳洲等20多个国家。在香梨出口贸易中，各主要香梨输入国都与我方签署有双边植物检疫议定书，比较关注苹果蠹蛾（Laspeyresiapomonella L.）、梨小 食心虫（Grapholitha molesta Busck）、香梨优斑螟（Euzophera pyriella Yang）等主要虫害。

目前，凭借形态学特征只能区分成虫和晚龄期害虫，大多数有害生物较短暂的幼虫阶段很难依靠形态学特征精确区分。苹果蠹蛾、梨小食心虫、香梨优斑螟等有害生物的幼虫基本在香梨采收时大量出现，有时仅剩残体，而香梨输入国对截获的检疫性有害生物和一般有害生物的货物处理、制裁和出口限制等差别很大。此类害虫的鉴定方法不成熟和分辨率低增加了香梨出口风险。近年来，国际上一些学者利用分子生物学方法对部分害虫进行鉴定，如新西兰Chen等［1］利用跨物种PCR扩增的方法，分析了苹果蠹蛾、梨小食心虫等4种近似种的33个微卫星位点，用于区分这些昆虫的种群和其基因流；美国Barcenas等［2］利用通用引物对苹果蠹蛾、杏小卷蛾、樱小卷蛾等几种国际检疫性害虫COI基因一段保守性序列（约470 bp）进行了克隆、测序、分析、比对，设计了针对每种害虫的特异性荧光定量PCR引物和探针序列，能准确检测和区分这几种害虫。

为改变香梨在出口贸易中有害生物检测鉴定的被动局面，本研究建立了简易可行、准确快速的试验检测平台，能够精确区分出口香梨中可能存在的形态学相似的有害生物，降低香梨出口风险。

1 材料与方法

1.1 材料

苹果蠹蛾、香梨优斑螟、梨小食心虫、地老虎DNA均由库尔勒出入境检验检疫局提供。

DNA提取试剂盒（Qiagen公司）；TaKaRa TaqTMHot Start Version（TaKaRa公司）；Recombinant Taq DNA Polymerase TaKaRa TaqTM（TaKaRa公司）；50 bp DNA Ladder（TaKaRa公司）；TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（TaKaRa公司）；TaKaRa Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）试剂盒（TaKaRa公司）。PCR仪：Bio-Rad公司；凝胶成像分析系统：TANON公司；ABI7500实时荧光定量PCR仪：美国应用生物系统公司；ND2000C核酸蛋白分析仪：美国热电公司；1-14ED小型离心机：德国Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 样品DNA提取 库尔勒出入境检验检疫局在沙依东园艺场，库尔勒市和农二师各团场注册果园开展有害生物调查，收集苹果蠹蛾、梨小食心虫、香梨优斑螟等有害生物的幼虫到成虫各阶段的虫体及残骸样本，经传统形态学鉴定后分类保存；使用DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒提取总DNA，并经DNA电泳和核酸蛋白分析仪检测提取的质量和浓度。样品提取时所用的肌肉组织量：苹果蠹蛾：单头 2.5-5.0 mg，多头（4-5只）16-18 mg；梨小食心虫：单头1 mg，多头（12-13只）12-16 mg；香梨优斑螟：单头2 mg，多头（3-5只）10 mg；地老虎：单头10 mg；单头加30 μL缓冲液进行洗脱，多头加60 μL缓冲液洗脱。DNA溶液于-20℃保存备用。

1.2.2 引物和探针设计 从NCBI数据库检索苹果蠹蛾、梨小食心虫、香梨优斑螟、地老虎COI特征序列，经BLAST后用DNA-star等软件比较其序列同源性，筛选出合理的目的片段基因后导入Primer premier 5.0进行引物设计，使用通用引物扩增COI基因片段，通过克隆测序，比对分析序列差异性，并在差异性区域设计种属特异性的引物，引物合成由TaKaRa（大连，中国）公司完成，表1所示。

表1 本试验所用引物序列

1.2.3 目的基因的定性PCR扩增检测 用1.2.2设计的4对引物分别对4种样品DNA进行PCR扩增，检测设计引物的特异性。反应体系：在200 μL 薄壁管中依次加入10×LA PCR BufferⅡ2 μL，dNTP mixture 3.2 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，Taq HS 0.2 μL，加ddH2O至20 μL。反应程序为：94℃预热1 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共35个循环；最后72℃延伸5 min。反应结束后取5 μL扩增反应液，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。将PCR产物送Invitrogen公司测序，每种测序2-3个重复。

1.2.4 DNA测序与探针设计 苹果蠹蛾、梨小食心虫、香梨优斑螟以及地老虎的PCR产物测序结果经分析后，通过NCBI中的BLAST比对，筛选出合理的目标片段基因，再导入ABI Primer Express 3.0和DNAMAN软件进行探针设计。在上下游引物间区域设计种属特异性的荧光探针，委托TaKaRa公司合成，表2所示。

表2 本试验所用探针序列

1.2.5 实时荧光定量PCR反应 反应体系（20 μL）含Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2×） 10.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）0.4 μL，探针（10 μmol/L）0.8 μL，ROX Reference Dye（50×） 0.4 μL，DNA 模板1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。反应参数设置为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火/延伸34 s，共40个循环。每个反应3个重复。

1.2.6 用标准曲线进行反应评估 4种蛀果害虫的DNA经系列梯度稀释后扩增，得出Ct值，构建标准曲线，判定反应的效率、重复性和检测范围。本试验将4种DNA分别进行5个浓度稀释（1×、10×、100×、1 000×、104×），稀释后进行荧光定量PCR扩增。绘制标准曲线，计算出样本标准差（s），并分析结果。

1.2.7 单多头DNA检测 将每种DNA按单多头分别进行扩增反应，检验DNA的单多头取样对后续扩增反应以及对引物探针特异性的影响。

1.2.8 DNA混合试验检测 将4种DNA进行混合，用4对引物以及对应的探针扩增，检测混合样本对扩增反应以及特异性的影响。

1.2.9 数据处理 实时荧光定量PCR反应结束后，由软件ABI7500 Sequence Detection Software自动对试验数据进行分析，得到各个反应的Ct值。在1.2.6反应结束后，制作关于DNA浓度对数和Ct值的标准曲线，计算标准曲线的斜率和R2值，检测曲线的线性程度，以及推算出对应的每种DNA的扩增效率，检测扩增反应的灵敏性和特异性。

2 结果

2.1 普通定性PCR检测结果

苹果蠹蛾、香梨优斑螟、梨小食心虫及地老虎的PCR产物测序结果经分析后，通过NCBI中的BLAST比对COI特征序列，序列同源性分别达99%（如与苹果蠹蛾FJ217755.2、FJ217756.2和FJ217764.2等序列比对）、97%（如与香梨优斑螟KC215198.1、KC442311.1和KC442309.1等序列比对）、99%（如与梨小食心虫AB603521.1、HQ5384-66.1和JF733841.1等序列比对）、99%（如与地老虎JX392593.1、JX392592.1和JX392591.1等序列比对）。并且，用针对苹果蠹蛾、香梨优斑螟、梨小食心虫和地老虎COI特征序列设计的4组引物对应扩增4种COI序列片段，电泳结果（图1）中都只出现一条带，表明4对引物的扩增特异性

2.2 实时荧光定量PCR检测结果

利用所选择的引物和探针序列进行荧光PCR扩增验证，得到的扩增曲线（图2），每一组引物和探针只能扩增目的DNA，其余对照样品无荧光信号，结果表明设计的引物和探针可以保证扩增的特异性。

2.3 重复性和灵敏性检测结果

根据荧光定量PCR反应得到的Ct值，绘制出了4个检测基因的标准曲线（图3）。标准曲线R2分别为0.998 9、0.997 6、0.990 0和0.973 8，斜率分别为-3.351 1、-3.275 3、-3.402 0和-3.105 4，计算出4个检测基因在检测浓度范围内的扩增效率分别为98.79%、101.98%、96.74%和109.9%。结果表明，苹果蠹蛾、香梨优斑螟、梨小食心虫及地老虎DNA溶液分别在1.605×10-2-160.5、0.729×10-2-72.9、0.475×10-2-47.52和0.818×10-2-81.78 ng/μL的检测范围内，荧光定量PCR起始模板浓度和Ct值之间具有较好的线性关系。由此确定这4个检测基因分别在模板质量浓度为1.605×10-2、0.729×10-2、0.475×10-2和0.818×10-2ng/μL时为有效扩增，即该质量浓度为最低检出限。

图1 引物对应扩增苹果蠹蛾、香梨优斑螟、梨小食心虫和地老虎COI DNA的定性PCR检测结果

图2 苹果蠹蛾（A）、香梨优斑螟（B）、梨小食心虫（C）和地老虎（D）COI 基因片段的实时荧光定量PCR扩增曲线

2.4 四种害虫的荧光定量PCR检测

将所建立的荧光定量PCR检测体系应用于苹果蠹蛾、香梨优斑螟、梨小食心虫和地老虎的日常检测。将这4种害虫的单、多头DNA样品和混合DNA样品分别用4组引物和探针组合扩增，结果显示各样品只有特异的引物和探针组合才能得到扩增，各个反应的PCR扩增Ct值汇总如表3所示。

3 讨论

苹果蠹蛾、梨小食心虫、香梨优斑螟等有害生物的幼虫基本在香梨采收时大量出现，有时仅剩残体，而香梨输入国对截获的检疫性有害生物和一般有害生物的货物处理、制裁和出口限制等差别很大。针对此类害虫的鉴定方法不成熟和分辨率低大大增加了香梨出口的风险。检疫性害虫的传统鉴定方法是通过形态学特征来识别，主要依赖于经验丰富的昆虫分类学专家。但对于残片、虫卵、形态学上难以区分的幼虫，形态学的鉴定就受到局限，同时鉴定所需时间长，不适合检验检疫部门快速检疫通关的要求［3］。近年来，以COI 条形码为目的片段，通过设计特异引物的特异性PCR检测鉴定方法已经开始用于一些昆虫种类的鉴定和区分［4-6］。

图3 苹果蠹蛾（A）、香梨优斑螟（B）、梨小食心虫（C）和地老虎（D）DNA溶液在检测范围内的标准曲线

表3 四种害虫荧光定量PCR检测结果

在荧光定量PCR试验分析体系的建立过程中，引物的设计是关键一步，要考虑到诸多因素。其中，Tm值是寡核苷酸的解链温度，以55-80℃为宜，上下游引物间的Tm值差异最好在10℃以内。G+C含量一般以40%-60%为好，上下游引物间的G+C含量差异在20%以内最好，这样可以适当提高引物的特异性。一般退火温度比Tm值低5-15℃［7］。另外，要避免引物中含有连续的G或C，但在引物的末端可以含G或C。本试验采用的4对引物的退火温度大多控制在56℃左右，这样就保证了它们在同样的PCR体系中能很好的扩增，达到检测目的。在PCR扩增反应的优化过程中，采用了适当提高退火温度的方法，尽可能保证引物的特异性。本试验所建立的荧光定量PCR扩增体系对苹果蠹蛾、香梨优斑螟、梨小食心虫和地老虎的检测特异性强，每组引物和探针只能扩增目的DNA，其他干扰DNA无荧光信号。

检出限是指检测系统中可检测的最低分析物浓度，又称分析灵敏度［8］，分为定性和定量检测低限，其中定性检测低限可再分为绝对和相对检测低限两种。绝对检测低限是指能被检测到的最低数量的原始模板拷贝或浓度。实时荧光定量PCR通过建立模板DNA浓度稀释梯度的标准曲线计算检出限。将标准曲线上的斜率代入公式E=10（-1/slope）-1，计算扩增效率，理想的扩增效率应在90%-110%之间［9，10］，本研究4个检测基因扩增效率分别为98.79%、101.98%、96.74%和109.9%，在可接受的PCR扩增效率范围内［9］。在最高稀释度的样品中，4个检测基因均得到扩增，Ct值接近检测临界限（Ct=35）［8，11］，结果表明本试验建立的分子检测体系灵敏度较高，4种害虫的最低检出限分别在1.605×10-2、0.729×10-2、0.475×10-2和 0.818× 10-2ng/μL，满足检验检疫日常检测需求。

由于在实际检测过程中，经常出现某一虫的残片样本或者几种虫聚集在一起的混合样本，本试验使用了单头、多头DNA样本及4种害虫的混合DNA样本进行检测分析，验证了该方法的特异性，可靠性和可适用性。此外，在实际的检验检疫工作中，对于未知害虫样本，为节约试剂和缩短检测时间，有可能需要用多对引物和探针组合来进行检测。

4 结论

本研究通过设计引物和探针，DNA测序，实时荧光定量PCR反应，建立了苹果蠹蛾、梨小食心虫、香梨优斑螟和地老虎4种害虫分子生物学鉴定方法，克服了只能通过形态学鉴定的限制。本试验还通过绘制标准曲线、单多头检测以及混合DNA检测，多方面验证引物和探针的特异性，检测体系的重复性和灵敏性。

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（责任编辑 狄艳红）

Rapid Identification of Four Kinds of Decay Fruit Moths by Real-time Fluorescence Quantitative PCR

Wang Fengjun1Liu Shasha2Feng Junli2
（1. Korla Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Korla 841000；2. Institute of Bioengineering，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou，Zhejiang 310018）

Laspeyresia pomonella， Euzophera pyriella Yang， Grapholitha molesta and Blank cutworm are important pets of fragrant pears and other fruits in Xinjiang， and they are also internationally important pests on inspection and quarantine. However， the identification relies mainly on morphological characters up to date. The lack of molecular detection methods greatly limits the international export trading of fragrant pears and related products. The 16S rDNA COI fragments from the four pests were cloned and sequenced. Then， specific primers and probes were designed according to the sequencing data， and the fluorescence Real-time quantification PCR detection system was established. The results demonstrates the limits of detection concentration of Laspeyresia pomonella， Euzophera pyriella Yang， Grapholitha molesta and Blank cutworm in this system are respectively 1.605×10-2，0.729×10-2，0.475×10-2and 0.818×10-2ng/μL， meeting the demand of inspection and quarantine routine testing. To overcome the residual bodies of some insects and some pieces mixed samples， or several insects together mixed samples appeared in actual testing process， DNA extracted from single， multiple and mixed pest samples were detected and evaluated， further verifying the specificity of this method， the reliability and applicability.

Laspeyresia pomonella；Euzophera pyriella Yang；Grapholitha molesta；Blank cutworm；Real-time fluorescence quantitative PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.011

2014-09-26

国家质量监督检验检疫总局资助项目（2012IK290），库尔勒市重点科技项目

王凤军，女，硕士，工程师，研究方向：植物病害和转基因检测；E-mail：wfj0808@126.com，刘莎莎为共同第一作者

冯俊丽，女，博士，研究方向：病原微生物的分子检测、检验检疫害虫的分子鉴定；E-mail：fengjunli0722@foxmail.com