张欣欣，王勇，杨庆斌

（安徽省合肥市第二人民医院呼吸内科，安徽合肥230001）

肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶、头孢菌素酶和qnr基因检测及耐药分析

张欣欣，王勇，杨庆斌

（安徽省合肥市第二人民医院呼吸内科，安徽合肥230001）

目的检测痰标本中肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、头孢菌素酶（AmpC酶）和qnr基因的存在情况及耐药性，为临床合理使用抗菌药物提供参考。方法收集痰标本中分离到的肺炎克雷伯菌114株，用琼脂稀释法检测耐药性，三维试验法和聚合酶链式反应（PCR）法检测ESBLs酶、AmpC酶及qnr基因存在情况。结果114株肺炎克雷伯菌中，ESBLs阳性58株（50.88%），产AmpC酶14株（12.28%），同时产ESBLs和AmpC酶10株（8.77%），qnr阳性2株；产酶株对抗菌药物的耐药率显著高于不产酶株。结论痰标本中肺炎克雷伯菌耐药基因的检测率较高，多重耐药明显；碳青霉烯类具有较好的抗菌活性。

肺炎克雷伯菌；细菌耐药；超广谱β-内酰胺酶；头孢菌素酶

肺炎克雷伯菌为呼吸道感染重要致病菌，患者病死率较高［1］。近年来，随着抗菌药物应用强度及程度的增加，肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药率呈不断升高趋势。产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、头孢菌素酶（AmpC酶）和qnr基因为肺炎克雷伯菌当前耐药的重要原因。笔者收集了114株痰标本中分离到的肺炎克雷伯菌，对其进行ESBLs，AmpC酶和qnr耐药基因检测及耐药性分析，为临床合理用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集来自安徽省多家医院送检的痰标本中分离出的114株肺炎克雷伯菌，菌株鉴定均由Vitek全自动微生物分析系统完成。

1.2 药物敏感性试验

采用琼脂稀释法，操作和结果判读按照美国临床和实验室标准协会（CLSI）2012版标准进行。其中选择大肠埃希菌ATCC25922为不产酶株，阴沟肠杆菌029M为AmpC酶质控菌株，肺炎克雷伯菌ATCC700603为ESBLs质控菌株，菌株均由安徽省细菌耐药监控中心提供。氨苄西林（AMP，山东齐鲁制药有限公司），哌拉西林他唑巴坦（TZP，美国Wyeth-Ayerst公司），头孢呋辛（CXM，上海新亚药业有限公司），头孢噻肟（CTX，安徽威尔曼制药有限公司），头孢曲松（CRO，台湾泛生制药厂股份有限公司），头孢他啶（CAZ，葛兰素史克公司），头孢吡肟（FEP，中美上海施贵宝制药有限公司），头孢西丁（FOX，海口制药厂有限公司），氨曲南（ATM，江西制药有限责任公司），亚胺培南西司他丁（IMP，默沙东公司），美罗培南（MEM，日本住友制药株式会社），庆大霉素（GEN，上海第一生化药业有限公司），环丙沙星（CIP，广州南新制药有限公司），加替沙星（GAT，南京圣和药业有限公司），左氧氟沙星（LVX，江苏豪森药业股份有限公司），阿米卡星（AMK，上海旭东海普药业有限公司）。

1.3 Am pC酶及ESBLs检测

酶粗提物制备：参考文献［2］描述的方法培养细菌，获得菌体沉淀，反复冻融提取细菌酶液，在4℃以10 000 r/min离心10min提取上清液。上清液经MH琼脂平板细菌培养阴性后置-20℃冰箱保存，备用。

AmpC酶和ESBLs检测：参考文献［2］提供的方法行AmpC酶和ESBLs的三维试验检测。将受试菌液接种MH琼脂平板上，取头孢西丁纸片置平皿中心，余操作按步骤进行。如观察到狭槽与抑菌圈交接处出现扩大的长菌区，视为AmpC酶三维试验阳性。ESBLs检测时用头孢曲松取代头孢西丁，余操作相同，如在狭槽与头孢曲松交界处出现扩大的细菌生长区域，视为ESBLs阳性。

1.4 细菌质粒提取与聚合酶链式反应（PCR）扩增

对其中10株同时产ESBLs和AmpC酶的肺炎克雷伯菌行qnr基因PCR扩增，直接煮沸法提取细菌质粒。根据Genbank数据库中公布的qnr基因序列设计PCR扩增引物，引物由北京赛百盛公司合成。PCR反应体系（50μL）包含：10×buffer 5μL，dNTPS mixture（2.5mmol/L）4μL，上下游引物各1μL（10μmol/L），rTaq酶（5μ/L）0.25μL，质粒模板4μL，上述试剂均购自大连宝生物公司。引物序列P1：5′-TCAGCAAGAGGATTTCTCA3′，P2：5′-GGCAGCACTATTACTCCCA 3′。PCR反应条件：预变性94℃5min，变性94℃1min，退火温度48℃40 s，72℃延伸1min共35次循环，再72℃延伸5min。扩增片段长度为627 bp，扩增过程中以大肠埃希菌ATCC25922及空白为阴性对照，标准产酶株为阳性对照。选取PCR扩增阳性的产物送上海生工公司进行纯化测序，测序仪器为ABIPRISM3730，测序试剂为BigDye terminator v 3.1，测序结果由GenBank blast程序行比对确定。

2 结果

2.1 产ESBLs及Am pC酶检测

在114株肺炎克雷伯菌标本中，其中产ESBLs58株，阳性率达50.88%；产AmpC酶14株，阳性率达12.28%；同时产ESBLs和AmpC酶10株，阳性率为8.77%。

2.2 PCR扩增

10株肺炎克雷伯菌行PCR扩增后，2株qnr检测阳性。将测序结果上网比对，与GenBank数据库所提供的qnr基因序列一致。

2.3 肺炎克雷伯菌耐药试验

结果见表1。AmpC酶、ESBLs及同时产AmpC酶和ESBLs菌株对16种抗菌药的耐药率均高于阴性菌株，其中产ESBLs菌株仅对美罗培南、亚胺培南、哌拉西林他唑巴坦、头孢他啶敏感，对其余抗菌药物的耐药率均达50%以上；产AmpC酶菌株除对碳青霉烯类药物敏感外，其他抗菌药物耐药率基本在60%以上，且产酶肺炎克雷伯菌株多重耐药现象明显。

表1 肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药率检测结果［株（%）］

3 讨论

肺炎克雷伯菌是医院获得性肺炎常见致病菌，分离率一直呈增多趋势［3］。随着抗菌药物的大量应用，肺炎克雷伯菌对药物的耐药性也呈现不断增强的趋势，耐药株不断增多，多重耐药现象也明显［4-5］，这其中最主要的原因是其能产生大量ESBLs和AmpC酶。β-内酰胺酶主要通过水解β-内酰胺环，使β-内酰胺类抗生素丧失活性。肺炎克雷伯菌对β-内酰胺类抗生素耐药的重要机制就是产生ESBLs，ESBLs通过水解青霉素、广谱头孢菌素及单环β-内酰胺类药物的β-内酰胺酶，导致抗生素耐药。本研究中检测了114株痰标本中肺炎克雷伯菌，其ESBLs阳性率高，达50%左右，可能与本地区医院抗生素使用强度和种类有关，易诱导ESBLs产生。产ESBLs株仅对碳青霉烯类、哌拉西林他唑巴坦及头孢他啶较敏感，对其余抗菌药物的耐药率均达50%以上，耐药率较高。非产酶株对抗菌药物的耐药率几乎均小于35%（除氨苄西林），产酶株对抗菌药物的耐药率明显高于不产酶株。哌拉西林他唑巴坦较敏感，提示含有酶抑制剂的抗菌药物可提高对产酶菌株的敏感性。头霉素类抗菌药物如头孢西丁对产ESBLs细菌有较好的抗菌作用，但本试验结果显示，其耐药性高，且头霉素类易诱导细菌产生AmpC酶，故临床不宜应用。检测提示头孢他啶相对较敏感，可能与本地区头孢他啶的使用率较低及基因表型有关。因ESBLs基因存在多种表型，对头孢菌素的水解能力有差异。但因临床治疗效果不佳，故其使用仍需慎重。

目前对AmpC酶稳定的药物主要有碳青霉烯类和第4代头孢菌素类（如头孢吡肟）。本检测结果显示，AmpC酶株对包括头孢吡肟在内的抗菌药物耐药率基本在60%以上，可能与第4代头孢使用强度高及这14株中的10株同时产ESBLs酶有关，导致其耐药率较高，应引起重视。但碳青霉烯类药物仍具有较高的敏感度，故一旦发现AmpC酶阳性株，应首选。

肺炎克雷伯菌对抗菌药物耐药率高的主要原因是其能产生大量的ESBLs和AmpC酶，可通过质粒介导，导致耐药菌的传播［6-7］。肺炎克雷伯菌是多种耐药质粒主要的宿主之一，因整合子、转座子等作用，1种质粒可同时携带多个耐药基因，使得产ESBLs和AmpC酶的肺炎克雷伯菌表现为多重耐药。在114株肺炎克雷伯菌中发现有10株同时产ESBLs酶和AmpC酶，阳性率达8.77%，本检测结果显示，除亚胺培南及美罗培南敏感外，对其余抗菌药物药率均超过60%，多重耐药比较严重。

细菌对喹诺酮类药物的耐药机制主要有药物作用靶位的改变、膜通透性改变及主动外排机制，这些机制由染色体介导，为主动耐药机制［8-9］。qnr基因编码的蛋白可保护细菌免受喹诺酮类药物的攻击，从而增强细菌的耐药性［10-11］。qnr蛋白仅引起对喹诺酮类药物的较低水平耐药，但由于其具有对其他耐药突变的保护作用，使菌群能达到二次突变的浓度，从而使细菌发生更高程度的耐药［12-13］。本研究中检测出2株qnr阳性，均同时产ESBLs及AmpC株，除美罗培南、亚胺培南外，其他14种抗菌药均耐药。虽然qnr基因检测率较低，但由于qnr基因所在的质粒常携带其他耐药基因（如aac，bla等），可在同种或不同细菌之间传播，引起细菌耐药性的增加，故临床危害大。

综上所述，痰标本中分离的肺炎克雷伯菌产生ESBLs及AmpC酶、qnr基因存在可能是其对抗菌药物耐药或多重耐药的主要原因。产酶菌除碳青霉烯类敏感，对大多数抗菌药物耐药率高。我国耐药监测数据表明，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物的耐药率为10%左右，虽然大多数菌株仍对其敏感，但美国2011年发生了碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌流行［14］，值得警惕。为防止肺炎克雷伯菌感染的发生和流行，只有合理应用抗菌药物，严格掌握用药原则；同时及时准确地进行细菌培养及ESBLs与AmpC酶、qnr基因的检测，才能为临床合理应用抗菌药物提供依据，以防止耐药菌产生。

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Analysis of Drug Resistance and Detection of ESBLs，Am pCβ-lactamases and qnr in K lebsiella Pneum onia

Zhang Xinxin，Wang Yong，Yang Qingbin
（Department of Respiratory Medicine，Hefei Second People′s Hospital，Hefei，Anhui，China 230001）

Objective To investigate the antibiotic resistance and detection of ESBLs，Ampcβ-lactamases and qnr in Klebsiella pneumonia isolated from the sputum，and to provide reference for clinical rational use of antibiotics.Methods A total of 114 strains of Klebsiella pneumonia were selected，Agar dilution test was used in susceptibility testing.The Genotes of ESBLs，AmpC and qnr was detected and analyzed by three-dimensional test and PCR.Results In the 114 strains of Klebsielinsla pneumonia，58 strains（50.88%）produced ESBLs and 14（12.28%）produced AmpCβ-lactamases，10（8.77%）produced both ESBLs and AmpCβ-lactamases，2 strains carried qnr；The rates of resistance to most antibiotics in drug resistant enzyme strain were higher than negative counterparts.Conclusion The Klebsiella Pneurnonia Producing drug-resistant gene isolated from the sputum are common，most of them are multiple drug resistant.Almost all strains were susceptible to Carbapenem.

Klebsiella pneumonia；resistance to Drug；qnr；ESBLs；Ampc

R969.3；R915

A

1006-4931（2015）22-0054-03

2015-05-13）