王文文，张东峰，汤敬谦

（1.广东轻工职业技术学院食品与生物工程系，广东广州510300；2.广东高校特色调味品工程技术开发中心，广东广州510300；3.暨南大学图书馆，广东广州510632）

黄皮果汁中酯酶产生细菌的选育与酶学特性研究

王文文1，2，张东峰1，2，汤敬谦3

（1.广东轻工职业技术学院食品与生物工程系，广东广州510300；2.广东高校特色调味品工程技术开发中心，广东广州510300；3.暨南大学图书馆，广东广州510632）

为获得优良酯酶产生菌，从自然发酵的黄皮果汁中进行筛选。通过对样品进行富集培养和平板初筛，从黄皮果汁中筛选出酯酶产生菌106株，然后再采用三乙酸甘油酯为唯一碳源进行驯化，摇瓶发酵等进一步进行筛选，通过测定酶活，最后获得1株优良酯酶产生菌C10。经形态特征、生理生化以及16S rDNA序列分析，断定该菌为蜡状芽孢杆菌属（Bacillus cereus.）。对菌株C10所产酯酶的部分酶学特性进行了研究，结果表明：该菌株所产的酯酶为碱性酯酶，最适作用pH为9.0，最适作用温度为60℃，且该酯酶具有较好的耐热性和碱稳定性。

蜡状芽孢杆菌；酯酶；酶学特性

酯酶（Esterase，EC3.1.1.1）是指能够催化羧酸酯的酶的总称，水解时催化酯键产生甘油和脂肪酸；合成时，把酸的羧基与醇的羟基脱水缩合，产物为酯类及其他香味物质，它广泛存在于动植物体内［1］。国内外的研究多集中在动植物酯酶上，而对微生物酯酶报道较少。而微生物酯酶与动物脂肪酶相比，具有更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，底物特异性和立体选择性［2］。微生物资源丰富，微生物酯酶已被广泛应用于医药、食品、化工、污水处理和生物修复等领域，微生物酯酶已成为研究热点［3-8］。本文以三乙酸甘油酯为底物，从自然发酵的黄皮果汁中筛选产酯酶优良的菌株，并从最适温度、最适pH、热稳定性及pH稳定性等方面研究酯酶的酶学特性。

1材料与方法

1.1材料与仪器

自然发酵的黄皮果汁。溴甲酚紫及三乙酸甘油酯等购自启隆生物科技有限公司，所有试剂均为分析纯。基础培养基：牛肉膏20.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，（NH4）2SO45.0 g/L，K2HPO45.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，NaCl 0.5 g/L，调pH至7.0，121℃灭菌20 min后加入三乙酸甘油酯10.0 mL/L（三乙酸甘油酯需乳化6 min，乳化剂为吐温）；选择性平板培养基：在基础培养基的基础上添加三乙酸甘油酯乳化液25.0 mL/L，琼脂20.0 g/L，溴甲酚紫0.04 g/L，pH 7.2，121℃，灭菌20 min；摇瓶复筛培养基：在选择性平板培养基的基础上去掉琼脂和溴甲酚紫，并且以三乙酸甘油酯为唯一碳源；产酶发酵培养基同基础培养基。

QYC-200全温度恒温培养摇床：上海福玛实验设备有限公司；A200基因扩增仪：杭州朗基科学仪器有限公司；RDY-SP1Z核酸电泳仪：北京荣阳经典科技有限公司；GI-1凝胶成像系统：通宝达成科技（北京）有限公司；KDC-210HR高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；PHS-3C雷磁酸度计：上海雷磁仪器厂；S22PC分光光度计：上海凌光技术有限公司。

1.2酯酶产生菌的分离纯化

取自然发酵的黄皮果汁样品3 mL加入到含有100 mL基础培养基的锥形瓶中进行富集培养，30℃恒温200 r/min培养36 h后，吸取10 mL培养液转接于含有90 mL新鲜基础培养基的锥形瓶中，仍在上述条件下富集培养。将富集培养的培养液进行梯度稀释，分别取一定量涂布在选择性平板培养基础上，30℃培养24 h，直至出现透明圈，用竹签挑取透明圈比较明显的单菌落划线分离纯化。依据透明圈直径与菌落直径比值的大小分离出优良酯酶产生菌。

1.3产酶发酵复筛

挑取酯酶产生菌单菌落接种于装有基础培养基的锥形瓶中，进行种子活化，待菌体长至对数生长期，离心收集菌体并接入产酶发酵培养基中，32℃，200 r/min发酵培养48 h，然后测定酯酶活力，根据酯酶活力筛选优良菌株。

1.4测定酯酶活力［9］

将培养好的发酵液于4℃，4000r/min离心15min，收集上清液，即得粗酶液。吐温与三乙酸甘油酯体积比2.5∶1混合，充分乳化，取5 mL乳化液，加pH7.0的磷酸缓冲液4 mL，室温保温6 min，然后加1 mL粗酶液，开始计时，继续保温10 min～30 min后，加20 mL 95%的无水乙醇终止反应。用灭活酶液作对照。作用后的酶液与对照组分别用0.05 mol/L的NaOH进行滴定，酚酞作指示剂，根据两者的碱液消耗差值计算酶活。酶活力单位定义为：在本实验条件下，每分钟释放出1 μmol游离醋酸所需的酶量为1个酶活力单位。

1.5菌株鉴定

参照《常见细菌鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》进行生理生化鉴定［10］，并进行16S rDNA基因序列分析。利用CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵法）对菌株总DNA（脱氧核糖核苷酸）进行提取，细菌16S rDNA通用引物进行序列扩增。上游引物序列为：5’-AGAGATTGATCCTGGCTCTG-3’；下游引物序列为：5’-GGTTTCCTTGTTACGACAT-3’。扩增反应体系如下（50 μL）：dNTP（10 mmol/L）1 μL，Mg2+（25 mmol/L）4 μL，forward primer（上游引物）（50 μM）0.5 μL，reverse primer（下游引物）（50 μmol/L）0.5 μL，模板DNA 1 μL，TaKaRa primer STAR HS高保真酶0.5 μL（5 unit/μL），10×buffer 5 μL，加ddH2O补足至50 μL。

扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性20 s，55℃退火10s，72℃延伸1.5min，34个循环；72℃延伸5min，保温5 min。使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收16S rDNA的基因片段，将纯化后的PCR产物送至华大基因有限公司测序。测序结果在NCBI的Genbank中进行相似性分析，并用Mega5.0软件构建系统发育树。

1.6酯酶酶学特性研究

酯酶的酶活力受外界条件的影响较大，本研究拟从酯酶反应的最适pH、最适温度、酯酶的pH稳定性及热稳定性等方面对酯酶的酶学特性进行初步探讨。

2结果与分析

2.1产酶发酵筛选结果

图1　10株菌的产酯酶活力Fig.1Esterase activity of 10 strains

从选择性平板培养基上挑选到106株产透明圈的菌株，经摇瓶发酵筛选，最终确定10株相对产酯酶较好的菌株，如图1所示。10株菌的产酶活力分布在7.88 U/mL～24.90 U/mL之间，其中C2，C4，C10三株菌产酯酶活力超过20 U/mL，C10产酯酶活力最高，达到24.90 U/mL，因此，选取该菌株进行深入研究。

2.2C10菌株的鉴定

菌株C10的菌落形态和普通显微镜照片（10×100倍）分别见图2-a和图2-b。经革兰氏染色，发现其为革兰氏阳性菌，菌体呈短杆状，单个或成对排列如图2-b所示。C10菌株的生理生化指标见表1。根据《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）的描述，初步判定该菌株为Bacillus sp。

图2　菌株C10菌落和革兰氏染色照片Fig.2Colony and gram stain photos of strain C10

表1　生理生化试验结果Table 1Results of physiology and biochemistry

菌株C10的16S rDNA利用通用引物进行PCR扩增后测序，将得到的基因序列在NCBI数据库中进行Blast，发现C10菌株与芽孢杆菌属（Bacillus）最相似。选取基因序列相似度较高的菌株，用Mega5.0建树如图3所示。由系统发育树可知，该菌株与Bacillus cereus最相似，进一步断定该菌株属于Bacillus cereus的一支。

图3　菌株C10的系统发育分析Fig.3Phylogenetic anlysis of strain C10

2.3酯酶酶学特性研究

2.3.1酯酶作用最适温度

粗酶液与底物混合，在pH7.0条件下，测定不同温度（20℃～70℃）下酯酶活力，结果如图4所示。

图4　温度对酯酶活力的影响Fig.4Effect of temperature on the activity of esterase

由图4可知，在20℃～60℃的范围内，随着温度的升高酯酶的活力逐渐提高，在60℃达到最高；超过60℃，酶活下降，因此选取60℃为酯酶作用的最适温度。

2.3.2酯酶作用最适pH

将酶液分别于不同pH（4.0～10.0）的缓冲液中，60℃温浴，测定酯酶活力。结果如图5所示。

图5　pH对酯酶活力的影响Fig.5Effect of pH on the activity of esterase

酯酶在pH 4.0时活力为零，随着pH增加酶活提高，在pH9.0时达到最大。pH超过9.0，酶活逐渐降低。因此，确定该酶为碱性酯酶，其最适作用pH为9.0。

2.3.3酯酶的热稳定性

将粗酶液分别在不同的温度下（40℃～80℃）处理1 h，然后冷却至室温，测定该酶相对于4℃下放置酶液的残余活力，即以4℃放置的酶液的酶活为100%。结果如图6所示。

该酶在40℃下相对酶活为85.26%，在80℃时仍具有39.85%的酶活，表明该酶具有较好的热稳定性。

2.3.4酯酶的pH稳定性

将粗酶液在不同pH缓冲溶液中处理24 h，测定该酶相对于pH9.0下放置的残余活力。结果见图7。

图6　酯酶的热稳定性Fig.6The thermal stability of esterase

图7　酯酶的pH稳定性Fig.7The pH stability of esterase

由图7可知，该酶在酸性环境中的稳定性较弱，相对酶活较低，而在碱性环境下随着pH增加，稳定性增加，在pH8.0时相对酶活保存74.61%，在pH10.0相对酶活保存86.87%，而在pH4.0时相对酶活保存只有10.62%，说明该酶具有较好的耐碱性。

3结论与讨论

从自然发酵的黄皮果汁样品中筛选到一株优良酯酶产生菌株C10，酶活达到24.90 U/mL。通过形态学特征，生理生化及16S rDNA基因序列分析，确定该菌为Bacillus cereus。研究了菌株C10所产酯酶的部分酶学特性，结果表明，菌株所产酯酶为碱性酯酶，其最适作用温度为60℃，最适作用pH为9.0，并具有较好的耐热性和碱稳定性。为使菌株C10能稳定产酯酶以及产酯酶能力提高，其发酵特性还有待于进一步研究。

［1］张敏文，刘悦，李荷.微生物酯酶的研究进展［J］.广东第二师范学院学报，2012，32（3）：66-71

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［10］东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：科学出版社，2001：43-65

Isolation of Esterase-Producing Strain from Juice of Clausena lansium Skeels and Characterization Study on the Esterase

WANG Wen-wen1，2，ZHANG Dong-feng1，2，TANG Jing-qian3
（1.Department of Food and Bioengineering，Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，Guangdong，China；2.Center of Guangdong Higher Education for Engineering and Technological Development of Specialty Condiments，Guangzhou 510300，Guangdong，China；3.Jinan University Library，Guangzhou 510632，Guangdong，China）

To screen out excellent esterase-producing bacteria，we screen it from natural fermentation juice of Clausena lansium（Lour）Skeels.106 strains were isolated by enrichment culture and plate isolation and 1 excellent esterase-producing train C10 was gotted by using glyceryl triacetate as the sole carbon source，shake flask fermentation and enzyme activity determination.Based on the physiological and biochemical test and 16 S rDNA gene sequence analysis，it concludes that the bacteria belong to Bacillus cereus.Then the enzymatic properties were studied and the results showed that it was an alkaline esterase，the optimal temperature and pH of the esterase were 60℃and 9.0 respectively.And The esterase with heat resistance and alkali stability.

Bacillus cereus；esterase；enzymatic properties

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.031

2014-04-17

广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZXB1103）；广东轻工职业技术学院自然科学基金项目（KJ201210）

王文文（1982—），女（汉），讲师，硕士研究生，从事生物工程方面的研究。