陈婷 孟建昇 谢华相

摘 要：该文从朗伯-比尔定律的基本原理入手，分析了定律在血液细胞分析仪血红蛋白浓度检测中的具体应用，为HGB测量单元的设计提供理论依据和参考。

关键词：朗伯—比尔定律 比色 血红蛋白

中图分类号：TM741.1 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2015）08（c）-0032-02

朗伯—比尔定律是比色分析的基本原理，描述了有色溶液对单色光的吸收程度与溶液浓度和光通过的溶液厚度之间的定量关系。朗伯—比尔定律在许多医疗仪器中都有应用，如血液细胞分析仪、生化分析仪、监护仪等，它的应用包含了机械、光学、化学、电子学等诸多学科方方面面的内容。

1 朗伯—比尔定律

当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度和液层厚度的乘积成正比，即：

A

式中，为吸光系数，它与吸光物质、入射光波长、溶液温度等因素有关；C为吸光物质的浓度；L为透光液层厚度；透射光强度I与入射光强度I之比称为透光度或透光率。

朗伯—比尔定律又称光的吸收定律，它是比色法分析溶液浓度及吸光物质含量的理论基础。

2 血红蛋白的检测方法

在血液细胞分析仪中，血红蛋白浓度的检测原理基本都是相同的。被稀释的血液加入溶血剂后，红细胞溶解，释放出血红蛋白，后者与溶血剂结合形成血红蛋白衍生物，进入血红蛋白浓度测定系统。在特定波长（一般在530～550 nm）照射下，吸光度的变化与液体中HGB（Hemoglobin血红蛋白）含量成比例。血红蛋白浓度可以通过朗伯—比尔定律，利用比色法进行测定。

采用比色法进行测定时，稀释液必须能使血中所有的血红蛋白都转变为一种稳定的血红蛋白衍生物。氰化高铁血红蛋白法能使除正常人体中很少含有的硫化血红蛋白外所有的血红蛋白都转化成稳定的氰化高铁血红蛋白，所测结果稳定，重复性好。因此，氰化高铁血红蛋白法已经成为ICSH（International Council for Standardization in Haematology）规定的测定血红蛋白浓度的标准方法。图1为ICSH推荐的氰化高铁血红蛋白溶液的吸收曲线图。HICN（hemiglobincyanide）最大吸收峰在540 nm。血液细胞分析仪HGB检测的校正必须以HICN值为标准。

不同系列血液分析仪配套溶血剂配方不同，形成的血红蛋白衍生物亦不同，吸光度各异，但最大吸收峰均接近540 nm。为了减少溶血剂的毒性，避免含氰化的血红蛋白衍生物检测后的污物处理，近年来，一些血液分析仪溶血剂使用无氰试剂。实验证明，其形成的衍生物与HICN吸收光谱相似，实验结果的精确性、准确性达到含有氰化物溶血剂的同样水平，既保证了实验质量又避免了试剂对分析人员的毒性和環境污染。

3 血液细胞分析仪的HGB测量组件

在血液细胞分析仪中，采用比色法对HGB进行测定。因此，HGB测量组件也就必须具备类似于分光光度计的各组件。

如图2所示，HGB测量组件大致可分为单色光源、比色皿、光电传感器和信号检测处理单元4部分。其中，前3个部分在机械加工、装配结构上要求具有良好的同轴度，保证光源发出的光线能够尽可能的垂直平行入射到比色皿的测量面上，且透射后的光线也应尽可能的垂直平行入射到接收端光电传感器的接收面上。保证朗伯—比尔定律应用对入射光特性的要求和检测灵敏度。

4 信号检测

光电传感器转换输出为一微弱电流信号。某光电二极管照度-电流转换图如图3所示。最大入射光强下光电二极管输出电流不足1 mA。信号检测的第一步就是把这个微弱的电流信号通过I/V变换转换成电压信号。

由于血红蛋白衍生物吸光特性稳定，故在进行HGB溶液透射光强测定时，该测定值可视为直流信号。因此，在I/V变换后可根据电路系统对A/D转换模拟信号输入范围增加一级直流放大电路，满足电路设计需求。

5 HGB测定

由于血液细胞分析仪的结构与分光光度计有较大差异，光源照射到比色皿表面的入射光强难以直接获得。因此，实际检测过程中通常以入射光透过稀释液的透射光强来代替入射光强。在这里稀释液就是检测过程中的参比溶液。

（1）参比溶液。

测定试样溶液的吸光度，需先用参比溶液调节透光度（吸光度为0）为100%，以消除其它成分及比色皿和溶剂等对光的反射和吸收带来的测定误差。由于血液细胞分析仪所用的稀释液和溶血剂均为无色透明，因此，参比溶液选择稀释液，以消除比色皿和溶剂对光的反射、吸收带来的误差。

设入射光强为I，通过参比溶液后的透射光强为I，吸光度为A，通过样本溶液的透射光强为I，吸光度为A，参比溶液下吸光度为A。

则：

；比色皿介质吸收及溶剂、器皿反射造成的消光。

A；

吸光度

令，参比溶液下的吸光度A，消除由于比色皿和试剂造成的消光影响。

有：AA。

（2）单组分测量方法。

单组分是指样品溶液中含有一种组分，或者是在混合物溶液中待测组分的吸收峰与其他共有物质的吸收峰无重叠。在特定试剂作用下，我们可以认为HGB检测是一种单组分测定。其定量方法包括标准曲线法、标准对比法和吸收系数法。

设溶液厚度为L，吸光物质浓度为C，介质吸收系数为k，入射光波长为，入射光强为，通过参比溶液后的透射光强为，通过样本溶液的透射光强为，参比溶液下吸光度为A。

由朗伯—比尔定律有

A为样品在特定波长下的吸光度

k为摩尔吸收系数，单位：升/厘米·摩尔；

L为样品池厚度，单位：厘米或毫米；

C为样品浓度，单位：摩尔/升。

对特定溶液而言，上式中只有溶液浓度C是未知量，因此，根据测得的光强值即可算出相应溶液的浓度。

（3）校准曲线法。

配制一系列不同含量的标准溶液，选用适宜的参比，在相同的条件下，测定系列标准溶液的吸光度，作A-C曲线，即标准曲线，也可用最小二乘数处理，得线性回归方程。

在相同条件下測定未知试样的吸光度，从标准曲线上就可以找到与之对应的未知试样的浓度。

（4）标准对比法。

即将待测溶液与某一标样溶液，在相同的条件下，测定各自的吸光度，建立朗伯-比尔定律，解方程求出未知样浓度与含量。

在HGB检测系统中，由于光源、比色皿、光电传感器等都不是理想器件，且由于制造、装配等因素，使HGB检测系统不可避免的存在个体差异。因此，在进行测定时，必须进行系统校正。这里面主要是指对样本溶液消光系数的校正。通常，通过标定等手段较易解决。

6 结语

该文从朗伯-比尔定律的基本原理入手，分析了定律在血液细胞分析仪血红蛋白浓度检测中的具体应用，为HGB测量单元的设计提供理论依据和参考。

朗伯—比尔定律在生化分析仪和监护仪中的应用与其在HGB检测中的应用大同小异，但由于具体应用场合的不同又各有特色。比如监护仪中采用双波长光源来检测血氧饱和度；而生化分析仪在检测时机上根据试剂反应特性采取终点法、固定时间法、动力学法等手段进行检测。定律在不同场合下的应用必然带来不同的设计需求，这些都有待我们去研究总结。

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