薛春霞等

摘要：使用电化学聚合法在碳糊电极（CPE）的表面制备了血红蛋白分子印迹聚合物膜，并对其制备条件进行了优化。结果表明，电聚合过程中扫描速度为0.05 V/s、聚合圈数为5、单体浓度为0.5 mol/L、交联剂浓度为0.10 g/mL时制备的修饰电极在循环伏安法铁化氰钾中的还原峰电流最弱，说明修饰电极的负载量达到最大。

关键词：分子印迹聚合物；血红蛋白；电化学传感器

中图分类号：O657.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）16-4019-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.048

The Preparation of Biological Macromolecules Imprinted Polymer

XUE Chun-xia1， LI Jing2， ZHANG Xiao-ran3

（1.Chutian College of Huazhong Agricultural University ， Wuhan 430205， China；

2. Xi'an University of Arts and Science， Xi′an 710065， China； 3. Xi'an University of Architecture and Technology， Xi′an 710055， China）

Abstract： Hemoglobin molecularly imprinted polymer membranes on the surface of carbon paste electrode （BHb/MIP-CPE） was prepared by electrochemical polymerization， and the preparation conditions were optimized. The results showed that the electrochemical polymerization of scan rates of 0.05 V/s， cycles for 5 times， the concentration of monomer（AM） for 0.5 mol/L and the concentration of cross linking agent（MBA） for 0.01 g/mL were optimization for reduction peak current of the modified electrode in 5.0 mM K3Fe（CN）6 of cyclic voltammograms， which indicated the modified electrode capacity reached the highest.

Key words： imprinted polymer； hemoglobin； electrochemical sensors

分子印迹聚合物对模板分子的立体结构具有“记忆”功能，从而对模板表现出高度选择性识别能力。依据功能单体和模板分子的作用机理不同，分子印迹可分为共价印迹和非共价印迹两大类。前者是模板分子与功能单体先通过共价键结合继而进一步聚合进行印迹的方法；而后一种方法是基于模板分子与功能单体之间通过氢键、离子键、π堆积、范德华力等形成预组织化合物，在此基础上进一步聚合得到印迹聚合物。鉴于分子印迹聚合物对模板的选择性识别能力，其作为分离富集材料和传感器的敏感元件以及催化剂等在诸多分析领域的应用前景一直备受关注[1]。然而迄今为止，有关分子印迹技术的研究大多停留在小分子的印迹上，人们在氨基酸[2，3]、金属离子[4]、小分子药物[5]等为模板的分子印迹研究中已经取得长足进步。而对于生物大分子，如蛋白质的分子印迹研究还鲜有成功的范例[6-8]。应用到电极表面的生物大分子印迹聚合物的研究也极少报道。电化学分析方法具有很高的灵敏度，简单方便，在传感器研究中被广泛应用为换能器。将具有特异选择性的分子印迹聚合物与电化学分析技术相结合，可以制备出具有高选择性和灵敏度的分子印迹电化学传感器。本试验将尝试在电极表面使用电化学方法引发丙烯酰胺制备血红蛋白分子印迹聚合物，并对印迹膜的性质、选择性及检测能力进行研究。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

电化学工作站CHI660B（上海辰华仪器公司）；扫描电子显微镜Quanta600FEG（宁波新芝生物科技股份有限公司）；超声波清洗机SB4200DTD（宁波新芝生物科技股份有限公司）；红外干燥箱CJ-1（上虞市道墟星峰仪器厂）；电子天平ESJ60-4（沈阳龙腾电子称量仪器有限公司）。

牛血红蛋白（BHb）（Sigama化学试剂公司）：溶液用磷酸盐缓冲溶液配制（0.01 mol/L，pH 7.0）；丙烯酰胺（AM）[梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]；N，N-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）（阿拉丁工业有限公司）；pH 7.0的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液；所用其他试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

试验采用循环伏安法、差分脉冲伏安法等电化学方法在CHI660B电化学工作站（上海辰华仪器公司）上和三电极单室电解池中进行。

碳糊电极（CPE）的制备：称取3.4 g光谱纯石墨粉和0.6 g液体石蜡置于小烧杯中，搅拌30 min，使其混合均匀呈糊状，取适量碳糊填入经乙醚和丙酮处理干净的PVC塑料管中，将铜丝固定到碳糊中，再将电极表面打磨光滑。完成后将电极在PBS缓冲溶液（0.10 mol/L pH 7.0）活化扫描。

2 结果与分析

2.1 BHb分子印迹聚合物膜修饰电极的初步制备

试验以碳糊电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。电聚合底液是10 mL KH2PO4-K2HPO4的缓冲溶液，在底液中依次加入50 mg BHb（模板分子），0.75 g AM（功能单体），0.1 g MBA（交联剂），0.25 g NaNO3和0.13 g K2S2O8（引发剂），超声波混合、溶解均匀。试验前，上述溶液通氮气除氧10 min，然后放入经过预处理的碳糊电极，在（-0.2）～（-1.4）V（vs.SCE）用循环伏安法循环扫描5圈，扫描速度为0.02 V/s。电聚合完成后在KH2PO4-K2HPO4的缓冲溶液中用循环伏安法检测BHb的氧化还原峰（图1）[9]。在（-0.2）～（-0.4）V出现BHb的还原峰，初步说明BHb已固定在电极表面上。为了进一步说明出现的峰是BHb的还原峰，特做了对比试验。将5 mg/mL BHb溶液用微量进样器滴涂到裸电极表面。等电极表面晾干后用同样的方法进行检测（图2）。由图2可知，在（-0.2）～（-0.4）V也同样出现与电化学聚合牛血红蛋白（BHb）一样的还原峰。

2.2 聚合物膜制备条件的优化

电化学聚合形成蛋白质分子印迹聚合物膜导电性很差，在本试验中使用铁氰化钾分子[K3[Fe（CN）6]作为探针，来间接考察印迹膜的检测特性。当蛋白质分子印迹膜很好的覆盖在电极表面时，铁氰化钾[K3[Fe（CN）6]的电化学信号就会很弱。反之，电化学信号会增强。所以优化电聚合条件时，比较峰电流高低可判断此条件下是否有利于电聚合。

2.2.1 电聚合时扫描速度的优化 电聚合过程中其他条件不变，只改变扫描速度（0.01、0.02、0.05、0.1 V/s）电聚合到同批的不同碳糊电极上。待电极表面晾干后取出，采用循环伏安法在铁氰化钾溶液中进行检测（图3）。由图3可知，扫描速度过慢时，使聚丙烯酰胺膜粗糙，易脱落，电极表面不能被膜完全覆盖，导致电化学信号增强，峰电流变大。扫描速度过快，使电极表面印记膜太致密，并且蛋白质模板深嵌在聚合物中难以洗脱。0.02 V/s到0.01 V/s这段峰电流呈下降趋势，但因为扫速太快使膜易脱落，所以不再研究比0.01 V/s还小的扫描速度。图3中显示扫描速度0.05 V/s时峰电流最小，扫描速度又不是很快，所以在此扫描速度下有利于电聚合。

2.2.2 电聚合时扫描圈数的优化 电聚合过程中其他条件不变，只改变扫描圈数电聚合到同批的不同碳糊电极上。本试验选择了3、5、10、20、30圈5个扫描圈数。待电极表面晾干后取出，采用循环伏安法在铁氰化钾溶液中进行检测（图4）。由图4可知，扫描圈数过少时，使聚丙烯酰胺膜粗糙，易脱落，电极表面不能被膜完全覆盖，导致电化学信号增强，峰电流变大。扫描圈数过多，使电极表面印记膜太致密，并且蛋白质模板深嵌在聚合物中难以洗脱。虽然扫描圈数为30圈时峰电流还是呈下降趋势，但因为其圈数太多，导致模板难洗脱，所以不再研究30圈以上的圈数。图4中显示在5圈时峰电流最低下，所以在此圈数下有利于电聚合。

2.2.3 电聚合时单体丙烯酰胺浓度的优化 电聚合过程中其他条件不变，只改变单体浓度电聚合到同批的不同碳糊电极上。单体初始浓度常选用0.5 mol/L，本试验选择了0.24、0.50、1.05、1.20、1.43 mol/L 5个单体浓度进行优化。待电极表面晾干后取出，采用循环伏安法在铁氰化钾溶液中进行检测（图5）。由图5可知，电聚合时单体浓度过低，导致聚丙烯酰胺断链或链过短而无法包裹住模板分子使电极表面无法完全被电聚合膜覆盖。单体浓度在0.5 mol/L时电化学信号最弱，所以在此浓度下有利于电聚合。

2.2.4 电聚合时交联剂浓度的优化 电聚合过程中其他条件不变，只改变交联剂浓度电聚合到同批的不同碳糊电极上。试验选择了0.05、0.10、0.20、0.30 g/mL 4个不同浓度，待电极表面晾干后取出，采用循环伏安法在铁氰化钾溶液中进行检测。交联剂的作用是使模板分子和功能单体形成高度交联、刚性的高分子聚合物，保持其三维空穴，不致于在洗脱、吸附模板分子的过程中空穴结构坍塌或变形，能保持原空穴的空间结构和识别位点的稳定。交联剂浓度不能过高，浓度过高会使空穴失去柔性，不利于洗脱（图6）。由图6可知，峰电流随着交联剂质量增大而降低，但在聚合过程中交联剂超过0.10 g/mL时，聚合液极易固化使电聚合不能正常进行。所以0.10 g/mL交联剂更有利于电聚合。

综上所述，按照以上优化条件制备出来的印记膜均匀、致密、印迹效果好。试验应以铂电极为对电极，以饱和甘汞电极作为参比电极，以碳糊电极作为工作电极。电聚合底液是10 mL KH2PO4-K2HPO4的缓冲溶液（0.01 mol/L，pH 7.0），在底液中依次加入50 mg BHb（模板分子），0.5 mol/L AM（功能单体），0.10 g/mL MBA（交联剂），0.25 g NaNO3和0.13 g K2S2O8（引发剂），超声波混合、溶解均匀。试验前上述溶液通氮气除氧10 min，然后放入经过预处理的碳糊电极，在（-0.2）～（-1.4）V（vs.SCE）用循环伏安法循环扫描5圈，扫描速度为0.05 V/s。试验完毕后，将电极用去离子水冲洗干净，先放入AcOH和SDS的混合液（AcOH 10%，SDS 10%）中洗脱2 h，然后放入0.5 mol/L H2SO4中洗脱l h，洗去模板分子，最后放入磷酸缓冲溶液中平衡30 min。对照电极的制备与上述过程相同，只是聚合液体中不加模板分子。

3 小结

在分子印迹技术中，选择合适的功能单体与模板分子键合是印迹过程非常重要的环节。丙烯酰胺及其衍生物类单体己被广泛研究和应用于水环境下分子印迹聚合物的合成，特别是蛋白质分子的印迹[10]。试验中，丙烯酰胺作为功能单体与蛋白质分子通过非共价键结合，围绕在蛋白质分子周围，形成特定的空间构型，聚合反应发生后，这种构型就会被保存下来。试验得出，电聚合过程中扫描速度为0.05 V/s、聚合圈数为5、单体浓度为0.5 mol/L、交联剂浓度为0.10 g/mL时制备的修饰电极在循环伏安法铁氰化钾中的还原峰电流最弱，说明修饰电极的负载量达到最大。在常规的化学方法制备聚丙烯酰胺中，一般使用氧化还原引发体系进行引收。本试验中，丙烯酰胺的聚合也是氧化还原引发过程，氧化剂是K2S2O8，还原剂是施加负电位的“电极”。当电极施加足够负的低电位时，K2S2O8首先被还原为阴离子自由基，该自由基再进而引发丙烯酰胺的聚合。上述反应方程式反应历程可以表示为：

S2O82-+e-→SO42-+SO4-

在交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）的作用下，聚丙烯酰胺在电极表面形成高交联度，结构致密的聚合物；如果聚合液体中含有蛋白质模板分子，模板分子会随着聚合物的形成一同印迹镶嵌在聚合物骨架中。

参考文献：

[1] 丁 超，曹姗姗.分子印迹技术在新领域的进展[J].化学工程与装备，2012（11）：155-156.

[2] 徐 雯，李 晓，张卫英，等.L-色氨酸分子印迹传感器敏感膜的制备与性能[J].高等学校化学学报，2012，33（10）：2199-2204.

[3] 赵 硕，崔莉凤，申 晴.谷氨酸分子印迹电化学传感器的研究[J].环境科学与技术，2012，35（11）：70-74.

[4] 李建玲，高 飞，张雅琨，等.Schiff碱基过渡金属镍络合物的电化学聚合：阳极电聚合中扫描速率的影响[J].物理化学学报，2010，26（10）：2647-2652.

[5] 郝明燕.红霉素分子印迹聚合物膜的制备及性能研究[D].西安：西北工业大学，2007.

[6] 周艳梅，徐文国，童爱军.硅胶表面牛血清白蛋白分子印迹聚合物的制备及分子识别性能[J].分析化学研究报告，2006，34（11）：1551-1554.

[7] 孙瑞丰，罗 晖，于慧敏，等.人血红蛋白分子印迹聚合物的制备及分子识别性能[J].过程工程学报，2005，5（3）：341-344.

[8] 刘 凯.新型分子印迹电化学传感器的研制及蛋白质直接电化学研究[D].长沙：湖南大学，2007.

[9] 史传国，衡姝婧，徐静娟，等.基于血红蛋白/硒化镉量子点多层膜的H2O2生物传感器[J].无机化学学报，2009，25（9）：1526-1531.

[10] 高 娜.分子印迹技术在蛋白质识别中的应用进展[J].化学研究与应用，2009，24（3）：337-343.