陈言峰 冯伟强 张辉华 陈建酬 张绮琼 邹记兴 付立霞

摘要 [目的] 分离并鉴定患病的高体革鯻（Scortum barco）的致病菌，并研究其药敏特性。[方法] 从濒死的高体革鯻体内分离到2株致病菌（FS1491、FS1492），通过其生理生化特征与16S rDNA序列分析对其进行鉴定;通过人工感染试验测定2株致病菌对高体革鯻的半致死剂量（LD₅₀）;最后，通过药敏试验确定其对抗生素的敏感性。[结果] 通过鉴定确定2株致病菌均为温和气单胞菌（Aeromonas sobria），此2株致病菌对高体革鯻的半致死剂量依次为2.1×10⁵和8.5×10⁴ cfu/g。该菌对头孢噻肟、环丙沙星、诺氟沙星和左氟沙星等抗生素高度敏感。[结论] 该研究可为防治温和气单胞菌引起的高体革鯻疾病提供参考。

关键词 高体革鯻;温和气单胞菌;鉴定;药敏试验

中图分类号 S941.42  文献标识码

A  文章编号 0517-6611（2015）03-133-03

Isolation and Identification of Pathogenic Bacteria Aeromonas sobria in Cultured Scortum barco and Their Antibiotic Susceptibility Test

CHEN Yanfeng¹， FENG Weiqiang¹， ZHANG Huihua¹， FU Lixia³* et al

（1. College of Life Science， Foshan University， Foshan， Guangdong 528231; 3. College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225009）

Abstract  [Objective] Pathogenic bacteria from diseased Scortum barco were isolated and identified， and their antibiotic susceptibility was studied. [Method] Two pathogenic bacterial strains （FS1491， FS1492） were isolated from moribund Scortum barco， and they were identified through physiological and biochemical characteristics test and 16S rDNA sequence analysis. The half lethal dose （LD₅₀） values for the isolates to Scortum barco were determined by the artificial infection experiment. Besides， the antibiotic susceptibility of the isolates was studied. [Result] These two bacteria were identified to be A. sobria. The LD₅₀ values for the isolates to healthy Scortum barco were 2.1×10⁵ and 8.5×10⁴ cfu/g， respectively. The result of antibiotic susceptibility test showed the isolates were highly susceptible to cefotaxime， ciprofloxacin， norfloxacin， levofloxacin and so on. [Conclusion] This study could provide references to prevent and control the disease of Scortum barco resulted from A. sobria.

Key words  Scortum barco; Aeromonas sobria; Identification; Antibiotic susceptibility test

基金項目 江苏省高校自然科学研究基金（11KJB240002）;广东省教育部产学研项目（2010b090400255）;广东省大学生创新创业训练计划项目（201411847059）;广东省普通高校青年创新人才项目;佛山科学技术学院校级科研项目。

作者简介 陈言峰（1981- ），男，山东潍坊人，讲师，博士，从事淡水养殖鱼类病害研究。*通讯作者，博士，从事水产动物抗逆性研究。

收稿日期 20141208

高体革鯻（Scortum barco），隶属鲈形目（Percifbrmes），鯻科（Theraponidae），革鯻属（Scortum），俗称宝石鲈、宝石鱼、翡翠鱼等，是我国从澳大利亚引进的一种优良的淡水经济鱼类。该鱼具有生长速度快、食性杂和适应性强等优良养殖性状，且肉味鲜美，骨刺少，蛋白质含量高，具有较高的经济价值和广阔的养殖前景^[1]。然而，随着集约化高密度养殖规模的不断扩大，高体革鯻的细菌性疾病日益严重，目前已有迟缓爱德华氏菌^[2]、无乳链球菌^[3]及海豚链球菌^[4]引发的高体革鯻病害的报道。笔者于2014年9月对来自广东省佛山市某养殖场的部分患病的高体革鯻进行了致病菌的分离鉴定、人工感染试验、抗生素敏感性试验，旨在为高体革鯻疾病的防控提供参考。

表2 人工感染试验结果

菌株菌液浓度

cfu/ml试验鱼数

尾死亡数

尾死亡率

%半致死剂

量∥cfu/g

FS14911.69×10⁴102202.1×10⁵

1.69×10⁵106602.1×10⁵

1.69×10⁶107702.1×10⁵

1.69×10⁷109902.1×10⁵

1.69×10⁸10101002.1×10⁵

1.69×10⁹10101002.1×10⁵

FS14921.69×10⁴104408.5×10⁴

1.69×10⁵107708.5×10⁴

1.69×10⁶108808.5×10⁴

1.69×10⁷109908.5×10⁴

1.69×10⁸10101008.5×10⁴

1.69×10⁹10101008.5×10⁴

2.4 16S rDNA序列分析

將FS1491和FS1492所扩增的16Sr DNA的序列 （Accession No.KP168436和KP168437）分别与GenBank中的序列进行比对，结果与温和气单胞菌同源性均为100%，进一步鉴定此2株菌为温和气单胞菌。从图1可以看出，FS1491和FS1492的16S rDNA序列与温和气单胞菌的16S rDNA序列自然聚类。

图1 根据FS1491和FS1492的16S rDNA序列构建的系统发育树

2.5 药敏试验 由表3可知，根据美国临床实验室标准化研究所（CLSI）抗菌药物敏感性试验执行标准（CLSI-M100-S18）^[9]，分离菌对头孢噻肟、环丙沙星、诺氟沙星和左氟沙星等抗生素高度敏感，对复方新诺明、头孢唑林、新霉素中度敏感，对利福平与林可霉素耐药。

3 讨论

温和气单胞菌广泛分布于养殖水体中，是危害我国淡水养殖业重要的致病病原之一。对水产养殖动物而言，温和气单胞菌属于条件病原菌，其主要致病因子为溶血素、肠毒素和细胞毒素等，在适宜条件下该菌即可大量繁殖而导致疾病暴发。温和气单胞菌感染的宿主较为广泛，目前已引起多种鱼类（如淡红墨头鱼（Garra rufa）^[10]、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）^[11]、河鲈（Perca fluviatilis Linnaeus）^[12]、黑鲫（Carassius carassius）^[13]、革胡子鲶（Clarias gariepinus）^[14]、斑点叉尾鮰（Ictalurus Punctatus） ^[15]、黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco） ^[16]、泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus） ^[17]等）的病害。该研究中从患病高体革鯻分离到温和气单胞菌，在国内外尚属首次。

表3 分离菌对17种抗生素的药敏试验结果

抗生素含量

μg/片抑菌圈直径∥mmFS1491FS14912

敏感性

阿米卡星3020.020.0S

卡那霉素3021.021.0S

链霉素   1017.017.0S

复方新诺明23.75/1.2513.012.5I

庆大霉素   1020.020.0S

头孢唑啉  3018.018.0I

四环素    3026.026.0S

头孢拉定 3023.524.0S

利福平    510.010.0R

强力霉素  3025.025.0S

林可霉素   29.59.0R

头孢噻肟  3036.036.0S

左氟沙星  527.027.0S

诺氟沙星  1026.026.5S

多粘菌素B 30012.012.0S

新霉素    3018.018.0I

環丙沙星  528.028.0S

注：“S”为高度敏感，“I”为中度敏感，“R”为耐药。

根据分离菌的形态学特征、生理生化特性的检测结果，参考《伯杰细菌鉴定手册》，鉴定2株致病菌均为温和气单胞菌。通过对扩增到的分离菌的16S rDNA序列进行分析，此2株菌与温和气单胞菌的同源性最高（100%）。用分离菌人工感染健康高体革鯻后，从死亡的鱼体内分离到了原感染细菌，证实此次分离到的2株温和气单胞菌即为该病的致病菌。FS1491和FS1492对高体革鯻半致死剂量分别为2.1×10⁵和8.5×10⁴ cfu/g，说明此2株菌对高体革鯻均具有较强的致病力^[18]。

尽管抗生素的使用会引发水产动物生理障碍及药物残留、环境污染、水体中有益菌群失调以及病原菌的耐药性等问题，但合理有效使用抗生素仍是目前水产养殖业细菌性疾病防治的主要方法。此次药敏试验结果表明，分离到的2株温和气单胞菌对头孢噻肟、环丙沙星、诺氟沙星和左氟沙星的敏感性高，可为该病暴发时治疗药物的选择提供参考。另外，此结果与童桂香等^[19]报道的黄沙鳖（Truogx sinensis）源温和气单胞菌菌株在对四环素和庆大霉素的敏感性、韩英等^[20]报道的黄河鲤（Cyprinus carpio haematopterus Temminck et Schlegel）源温和气单胞菌菌株对卡那霉素的敏感性以及李槿年等^[21]报道的鳗源温和气单胞菌菌株对环丙沙星的敏感性均有差异，这可能与菌株来源于不同动物或养殖过程中长期使用某些药物导致致病菌产生耐药性有关。在防治温和气单胞菌引起的鱼类疾病过程中，药物的选用应以不同菌株的药敏试验结果为主要依据，避免因滥用药物导致该菌产生耐药性从而降低防治效果。

43卷3期                陈言峰等 高体革鯻温和气单胞菌的分离·鉴定及药敏试验

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