张贺翠 廉小平 柳菁 李帮秀 周燕

摘要  [目的]通过PCR和RTPCR技术从甘蓝、白菜和萝卜中扩增ROH1基因序列，分析该基因的基本特性。 [方法]采用生物信息学的相关方法进行分析。[结果] 甘蓝、白菜、萝卜ROH1基因没有内含子，甘蓝ROH1基因编码398个氨基酸，白菜和萝卜ROH1基因均编码400个氨基酸，3种植物的ROH1蛋白序列与拟南芥已经公布的ROH1（At1g63930）蛋白氨基酸缺少一段连续的氨基酸序列;ROH1属于DUF793蛋白超家族，它没有跨膜结构域和信号肽，二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲构成。同源比对及功能联想分析发现植物中ROH1非常保守，系统发育分析表明甘蓝、白菜和萝卜的关系最近;结构功能分析发现ROH1可能与BYPASS蛋白和AT4G11300蛋白的功能相似。[结论] 为研究DUF793蛋白超家族功能提供参考。

关键词 ROH1基因;基因克隆;DUF793蛋白超家族

中图分类号 S188  文献标识码

A  文章编号 0517-6611（2015）03-018-04

Cloning and Analysis of ROH1 from Three Brassica Plants

ZHANG Hecui， LIAN  Xiaoping， LIU Jing et al

（College of Agronomy and Biotechnology ， Southwest University ， Chongqing 400716）

Abstract   [Objective]The sequences of ROH1 genes were amplified by PCR and RT-PCR from three Brassica plants which are Brassica oleracea， Brassica rape and  Raphanus sativus. [Method]Using relevant methods of bioinformatics analyzes. [Result] The results indicated that the gDNA of ROH1 was without introns， ROH1 gene encodes 398 amino acids in Brassica oleracea when it encodes 400 amino acids in the Brassica rape and Raphanus sativus. A continuous period of amino acids was deleted from the ROH1 in the three plants which were compared to ROH1 （At1g63930） in Arabidopsis thaliana; ROH1 belonged to DUF793 protein superfamily， and it might not be a transmembrane domain with no a signal peptide. The secondary structure of ROH1 mainly composed of αhelix and random coil constituted. Homologous alignment and function of the association analysis showed that ROH1 was very conservative， and phylogenetic analysis showed that there were closely relationship between Brassica oleracea， Brassica rape and  Raphanus sativus; The structure and function analysis found that ROH1 may resemble to BYPASS protein and AT4G11300 protein . [Conclusion] The study provided a reference for the study of function about DUF793 protein super family.

Key words  ROH1 gene; Gene clone;  DUF793 protein super family

基金項目 中央高校基本业务费专项经费（XDJK2013C121）

作者简介 张贺翠（1985- ），女，河南滑县人，助理实验师，硕士，从事生物化学与分子生物学方面的研究。

收稿日期 20141125

囊泡分泌和转运过程是真核细胞生命活动的基本事件之一，是神经信号传导和内分泌激素释放的基础，细胞内大多数重要的信号蛋白或者膜蛋白需要借助囊泡的转运和分泌来实现^[1]。囊泡转运和分泌过程中，由多亚基组成的7类复合物被证明在真核细胞的内膜转运和囊泡拴系过程中发挥重要作用。其中研究最为活跃和进展最快的是Exocyst，它是由SEC3、SEC5、SEC6、SEC8、SEC10、SEC15、EXO70 和 EXO84 8亚单位构成^[2]。

Elias等^[3]首先从水稻和拟南芥中发现了EXO70A1，它是EXO70家族中的一员。Li等^[4]研究显示EXO70A1介导的膜泡运输参与了导管细胞次生壁的形成，EXO70A1突变导致导管运输功能障碍，进而影响拟南芥的生长和育性，SEC8则和Exo70、SEC6形成一个稳定的亚复合体。Ivan等^[5]在拟南芥中发现EXO70A1和SEC8同时与另一种蛋白ROH1相互作用，ROH1突变引起种子中果胶沉积的消失;拟南芥ROH1（At1g63930）基因没有内含子，编码415个氨基酸，属于一种未知功能的DUF793蛋白家族成员之一，DUF793家族在拟南芥中至少含有11个成员，分别为At1g01550，At1g18740，At1g22030，At1g43630，At1g74450，At1g77855，At2g46080，At4g01360，At4g11300，At4g23530;据预测ROH1与BYPASS1（At1g01550）基因的结构具有高度相似性，BYPASS1与根冠的运输有关，因此ROH1蛋白可能参与囊泡转运^[6]。但目前对甘蓝、白菜和萝卜ROH1蛋白编码序列及其蛋白质结构的研究尚未见报道。

笔者以高度自交不亲和甘蓝E1、白菜和萝卜为材料，利用PCR和RTPCR的方法，首次对甘蓝、白菜和萝卜的ROH1蛋白编码序列进行了克隆与序列分析，进一步了解该编码序列的结构与功能，并探究ROH1序列及其编码的蛋白质在甘蓝、和拟南芥中存在的结构和功能差异。

1 材料与方法

1.1 材料 供试材料为高度自交不亲和甘蓝E1、白菜和萝卜。

1.2 方法 利用植物基因组DNA提取试剂盒（Tiangen，北京）提取甘蓝叶片gDNA。各个时期柱头和其他组织RNA的提取参照RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒（Tiangen，北京）操作说明进行。使各种材料RNA量相同，以等体积Oligo dTprimers和random6 mers混合物为引物，参照Primescript反转录试剂盒（TakaRa，日本）操作说明合成cDNA第一条链。反转录完成后，-20 ℃保存备用。

以甘蓝、白菜和萝卜的gDNA和cDNA为模板扩增ROH1基因，ROH1上游引物：CGCAAGTAATCAAGGCTCG，下游引物：GAAACTTTCCCGGCTTGCTC，反应参数：94 ℃ 4 min;94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35个循环;72 ℃ 10 min终止。扩增产物经1%（W/V）琼脂糖凝胶电泳检测后，以DNA胶回收试剂盒纯化回收。产物回收后与T载体连接，将重组克隆载体导入大肠杆菌感受态DH5α中，挑取阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

1.3 數据分析

序列分析和系统分析分别采用VecoterNTI、MEGA6，在线分析软件分别使用NCBI、COILS、TMHMM2.0、SignalP、GeneMANIA等。

2 结果与分析

2.1 ROH1基因克隆及进化分析

以甘蓝E1、白菜、萝卜为材料，利用PCR及RTPCR扩增产物ROH1，连接PMD19-T载体，送华大基因组测序，结果表明，ROH1的全长gDNA序列与cDNA序列完全一致，均为1 197 bp;萝卜和白菜的全长gDNA序列与cDNA序列长度均为1 203 bp，完全等同于1%（W/V）琼脂糖凝胶电泳的结果（图1）。

经测序和比对发现（图2），甘蓝中ROH1编码区序列和gDNA序列都是由1 197 bp构成，表明甘蓝中ROH1没有内含子，编码398个氨基酸;萝卜和白菜的核苷酸序列长度均

注：M.Marker，1.甘蓝gDNA，2.甘蓝gDNA，3.白菜gDNA，4.白菜gDNA，5.萝卜gDNA，6.萝卜cDNA。

图1 ROH1的cDNA 和gDNA的PCR产物电泳图谱

注：Bo.甘蓝;Br.白菜;At.拟南芥;Rs.萝卜。

图2 ROH1蛋白氨基酸的序列比对

安徽农业科学                         2015年

为1 203 bp，编码400个氨基酸。通过NCBI下载拟南芥ROH1 基因序列（序列号：At1g63930），经blast及VecoterNTI与已公布的拟南芥ROH1氨基酸序列比对发现，4条序列的相似性达到87.6%，说明ROH1基因的保守型很强。甘蓝中ROH1与拟南芥中ROH1的相似性达到92%，白菜中ROH1与拟南芥中ROH1的相似性达到89.5%，萝卜中ROH1与拟南芥中ROH1的相似性达到90.2%;甘蓝中ROH1氨基酸序列比拟南芥中的ROH1氨基酸序列少17个氨基酸残基，其中甘蓝第56、57位点氨基酸比拟南芥中ROH1多2个氨基酸残基，甘蓝第299位点氨基酸比拟南芥中ROH1氨基酸序列少1个氨基酸残基，甘蓝中ROH1比拟南芥中少一段连续的16个氨基酸序列，对应于拟南芥序列第191～208位点氨基酸残基，序列为GGGGGNKTTERSWSFGR。白菜和萝卜第56～58位点氨基酸比拟南芥ROH1多3个氨基酸残基，同样在对应于拟南芥第192～208位点氨基酸处少一段连续的氨基酸序列，序列为GGGGGGNKTTERSWSFGR。结构域预测发现，萝卜、甘蓝、白菜和拟南芥中的ROH1基因与DUF793蛋白质超家族的结构一致性很高（图3）。

图3 ROH1蛋白结构域预测

进化树可以描述来自于同一祖先的不同植物在进化过程中的关系，通过构建物种进化树，可以了解某种物种在进化过程中的地位。依据氨基酸序列构建的分子进化树能较真实地反映不同物种之间的系统分类学关系和自然演化进程，对明确判断物种间的亲缘关系具有一定的参考价值。利用MEGE6软件对DUF793蛋白超家族的多个物种构建进化树，由图4可知，在DUF793家族进化树中，甘蓝、白菜和萝卜

注：Bo.甘蓝;Br.白菜;At.拟南芥;Rs.萝卜;At4g11300等见表1。

图4 多个物种DUF793蛋白超家族氨基酸进化树分析

ROH1蛋白聚在一起，和油菜、拟南芥聚在一支，说明甘蓝、白菜和萝卜

ROH1蛋白可能与AT4G11300具有相似的功能。

2.2 ROH1卷曲螺旋及跨膜结构域分析

对ROH1二级结构预测发现（表2），甘蓝、白菜和萝卜中ROH1的二级结构可能存在α螺旋、β转角、无规则卷曲、延伸链，其中α螺旋占整条序列二级结构的比例最高，其次是无规则卷曲，β转角和延伸链占的比例非常小，由此可知，ROH1的二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲构成。

蛋白质卷曲螺旋是一种超二级结构，通常由2～7个α-螺旋互相缠绕形成麻花状结构，其中2个或4个α-螺旋互相缠绕最为常见，含卷曲螺旋结构的蛋白质是纤维状蛋白质的主要结构模式，在植物生命体中具有重要意义。通过在线分析工具COILS 对甘蓝、白菜和萝卜ROH1进行预测，结果见图5。由图5可知，3个物种的ROH1在对应于甘蓝氨基酸350～380处均存在卷曲螺旋结构。

用TMHMM2.0预测甘蓝、白菜和萝卜ROH1蛋白无明显跨膜区（图6），蛋白全部位于膜外。用SignalP分析ROH1的信号肽，通过不断截短的方式最后发现ROH1没有信号肽。

2.3 ROH1信号路经分析

GeneMANIA可以发现信号途径或蛋白复合体的新成员，可作为蛋白筛选结果的补充。使用该工具对ROH1进行检索，结果见图7。由图7可知，拟南芥中发现ROH1与EXO70家族的EXO70A1和EXO70E2相互作用，数据库中还存在18种与ROH1蛋白共沉淀、共表达和具有相同结构域的蛋白。数据库中有8种蛋白与ROH1具有相同的结构域，这些蛋白均属于DUF793蛋白超家族，大多数为功能研究较少的蛋白，其中

AT2G46080和AT1G22030编码类BYPASS蛋白。AT1G43630、AT1G74450、AT1G01550

与形态发育有关;AT4G23530、AT2G46080、AT1G18740是与

表1 多个物种的信息

序列号物种序列号物种

XP_007222897.1Prunus persicaBAF29255.1Oryza sativa Japonica Group

XP_004173411.1Cucumis sativusQ9LMM6.1Arabidopsis thaliana

CBI34385.3Vitis viniferaAEE29757.1Arabidopsis thaliana

XP_006305065.1Capsella rubellaAt1g77855Arabidopsis thaliana

XP_006434464.1Citrus clementinaAT4G23530Arabidopsis thaliana

KDO86277.1Citrus sinensisAt4g11300Arabidopsis thaliana

XP_006413544.1Eutrema salsugineumAEE82015.1Arabidopsis thaliana

NP_001240854.1Glycine maxAT2G46080Arabidopsis thaliana

NP_001144572.1Zea maysAT1G74450Arabidopsis thaliana

AET04440.1Medicago truncatulaAT1G43630Arabidopsis thaliana

XP_007160104.1Phaseolus vulgarisAT1G22030Arabidopsis thaliana

XP_008365274.1Malus domesticaAtROH1Arabidopsis thaliana

EES19085.1Sorghum bicolor

表2  3種不同植物ROH1蛋白二级结构预测结果%

名称α螺旋延伸链β转角无规则卷曲

BoROH154.529.304.7731.41

BrROH160.753.501.7534.00

RsROH160.004.002.0034.00

囊泡运输有关的蛋白;AT1G22030、AT4G11300是与Exocyst有关的蛋白;AT1G74450、AT1G01550是与根系形态发育有关的蛋白。与进化树分析结果一致。

3 讨论

甘蓝ROH1基因编码398个氨基酸，白菜和萝卜ROH1基因编码400个氨基酸，均比拟南芥ROH1少一段连续的氨基酸序列，可能是物种进化中自然选择造成的，因此这3种植物ROH1在进化上较接近，在DUF793进化树中聚在

一支而与拟南芥较远。在对甘蓝、白菜和萝卜ROH1蛋白的二级结构预测中，发现3种植物ROH1都没有跨膜结构，ROH1可能主要由α-螺旋和无规则卷曲构成，存在卷曲螺旋超二级

注：绿、蓝、黄线分别表示不同尺寸窗口的预测。

图5 ROH1卷曲螺旋预测

图6 ROH1跨膜结构预测

图7 ROH1蛋白的功能联想数据分析

结构^[7]，预测有一定

的准确度且ROH1蛋白的氨基

酸序列的疏水性不是很强，可能预测不出来。信号肽是新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的N-末端的氨基酸序列，一般由 16～26 个氨基酸组成，包括一个带正电荷的 N-末端，一个中间疏水序列和一个较长的带负电荷的 C-末端，通过不断截短的方式预测发现ROH1蛋白没有信号肽。

ROH1是Ivan等利用酵母双杂交、定点突变等技术从拟南芥中筛选出来的蛋白，它与Exocyst复合体中的EXO70A1、EXO70E2和SEC8相互作用，通过与EXO70家族基因之间的共调控表明ROH1和Exocyst复合体之间存在某种联系;据Ivan推测ROH1的突变可以引起种皮果胶的沉积，破坏了种皮的正常功能，因此ROH1可能是分泌的负调节因子。ROH1属于DUF793蛋白超家族，通过GeneMANIA 预测发现与ROH1有共同结构域的8种蛋白质均属于DUF793家族，其中5种蛋白与分泌和囊泡运输有关;Van等^[8]研究发现ROH1与BYPASS1（At1g01550）基因的结构具有高度相似性，BYPASS1与根冠的运输有关;Kang等^[9]推测BYPASS及其同源基因在不同物种和不同组织中具有不同的生物学功能;其他研究结果也表明BYPASS可能广泛参与了各种生理活动^[9-10]。刘豫东等^[11]从甘蓝的柱头内扩增出BYPASS基因，据推测BYPASS蛋白可能参与了甘蓝的生殖发育过程;AT2G46080和AT1G22030编码类BYPASS蛋白与ROH1蛋白具有相同的结构域，因此ROH1蛋白也可能与根冠运输和生殖发育有关。进化分析发现甘蓝、萝卜、白菜ROH1蛋白可能与DUF793蛋白超家族的AT4G11300蛋白功能相似^[12]，AT4G11300蛋白与Exocyst相关（raghvendra），与Ivan等发现的ROH1和Exocyst复合体之间存在某种联系这个观点一致，同时说明DUF793蛋白家族可能具有抑制分泌的功能。

应用生物信息学的方法对 ROH1 的结构和功能进行预测和分析，有利于利用试验的手段研究植物ROH1 的分子生物学性质和理化性质，对物种间 ROH1家族的亲缘关系和遗传相似性的分析，对新ROH1基因的发现和研究有较大的帮助^[13]。Ivan等在拟南芥中发现ROH1蛋白与EXO70A1、

EXO70E2和SEC8相互作用，甘蓝、白菜、萝卜ROH1蛋白比拟南芥ROH1蛋白少一段连续的氨基酸序列，因此甘蓝、白菜、萝卜ROH1与Exocyst复合体亚基是否存在相互作用，ROH1是否与分泌和囊泡运输有关，ROH1是否与生殖发育

有关，这些都是下一步研究的内容，以期为研究DUF793蛋白超家族功能提供参考。

参考文献

[1]

WHYTE J R，MUNRS. Vesiele tethering complexs in membrane traffie[J].Cell Sei，2002，115：2627-2637.

[2] NOVICK P， FIELD C， SCHEKMAN R. Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway[J]. Cell， 1980，21：205-215.

[3] ELIAS M，DRDOVA E，ZIAK D，et al.The exocyst complex in plants[J].Cell Biology International，2003，27：199-201.

[4]  LI S，VAN OS G M，REN S，et al. Expression and functional analyses of EXO70 genes in Arabidopsis implicate their roles in regulating cell type-specific exocytosis[J]. Plant Physiol， 2011， 154：1819-1830.

[5] IVAN KULICH，REX COLE，EDITA DRDOVA，et al. Arabidopsis exocyst subunits SEC8 and EXO70A1and exocyst interactor ROH1are involved in the localized deposition of seed coat pectin[J]. New Phytologist，2010，188：618-625.

[6] 魏香，曾宪纲，周海梦蛋白质结构中卷曲螺旋的研究进展[J].中国生物化学与分子生物学报， 2004，20（5）：565-571.

[7] RAGHVENDRA SHARMA， PUSHP PRIYA， MUKESH JAIN. Modified expression of an auxinresponsive rice CCtype glutaredoxin gene affects multiple abiotic stress responses[J]. Planta，2013，238： 871-884.

[8] VAN NORMAN J M， FREDERICK R L， SIEBURTH L E. BYPASS1 negatively regulates a root-derived signal that controls plant architecture[J]. Current Biology，2004，14：1739-1746.

[9] KANG Y M，KIM R N，CHO H S，et al.Sliencing of a baypassl homologs results in root-independent plejotmhpjc developmental defects in Nicotiana benthaminaa[J].Plant Mol Biol，2008，68（4/5）：423-437.

[10] LEE D K， VAN NORMAN J M， MURPHY C， et al. In the absence of BYPASSlrelated gene function， the bps signal disrupts embryogenesis by an auxinindependent mechanism[J]. Development，2012，139（4）：805-815.

[11] 刘豫东，高启国，曾静，等.甘蓝BYPASSl编码基因的克隆与表达分析[J].中国蔬菜，2013（16）：22-28.

[12] WINTER D， VINEGAR B， NAHAL H，et al. An “electronic fluorescent pictograph” browser for exploring and analyzing large-scale biological data sets[J].PLoS ONE，2007，2：718.

[13] 董嬌，周军，辛培尧.等.不同植物LDOX/ANS基因的生物信息学分析[J].基因组学与应用生物学，2010，29（5）：815-822.