敖家富　冀文娟　张　静　顾国浩蒋敏

HBV感染后慢性化进展过程中miRNA表达HBV基因型 P基因点突变的研究

敖家富冀文娟张静顾国浩★蒋敏

目的 探讨HBV感染引起的肝脏病变慢性化进展为慢性乙肝、肝硬化、肝癌之相关因素，分析各因素在肝脏病变慢性化演变过程中的作用及在诊断、治疗、判断预后中的应用价值。方法 采用xMAP液态芯片技术定量检测HBV相关肝病标本中PBMCmiR-191、-223、-222、-145、-21、-31、-126、-20a、-372的表达水平；采用直接测序法检测相应血清标本HBV基因型及P基因区耐药位点突变；对HBV相关肝病慢性化进展的各可能相关因素包括性别、年龄、HBV基因型、HBV DNA载量水平、HBeAg状态、miRNA表达水平作多因素Logistic回归分析，探讨参与HBV感染引起的肝脏病变慢性化演变过程的相关因素。结果 HBV C基因型、DNA载量持续高水平表达、miR-20a表达上调、miR-126及miR-223表达下调是在乙肝慢性化进展中有统计学意义的影响因素（P＜0.05），而HBeAg状态、自然状态下发生的耐药相关位点突变，年龄、性别等因素差异无统计学意义（P>0.05）。结论 C基因型，HBV DNA持续高载量以及miR-126、-223低表达，miR-20a高表达可能是导致乙肝慢性化的相关因素，尤其可能是肝癌发生的危险因子，常规检测基因型、HBV DNA及miRNA的定量检测可为监测病情、判断预后、及时治疗预防乙肝慢性化进展提供资料。

HBV基因型 xMAP液态芯片 miRNA P基因突变

乙型病毒性肝炎是世界范围的严重公共卫生问题之一，我国是乙肝感染大国，全国1～59岁人群乙肝表面抗原携带率为1.18%［1］，80%～90%的急性HBV感染者可发展为慢性乙型肝炎（CHB），其中20%～30%可发展为肝硬化（LC）或肝癌（HCC）。在我国约90%的肝细胞癌患者均合并HBV感染［2］。作者通过收集未曾服用核苷类抗病毒药物的病例，采用直接测序法检测HBV DNA P基因区部分序列并对其分型，将HBV基因型及P基因区自发耐药相关突变、性别、年龄、HBV DNA载量水平、HBeAg状态进行多因素Logistic回归分析，探讨参与HBV感染者肝病慢性化进展的相关因素。

1　材料与方法

1.1一般资料 收集苏州大学附属第一医院及亳州市人民医院2010年10月至2011年12月住院和门诊HBV感染者169例，其中男126例，女43例；年龄（45.51±12.87）岁。其中急性乙型肝炎（AHB）患者40例、慢性乙型肝炎（CHB）患者53例、肝炎后肝硬化（LC）患者44例、HCC患者32例及健康对照（NC）40例，诊断符合2010年中华医学会传染病与寄生虫分会、肝病学分会联合修订的“慢性乙型肝炎防治指南”诊断标准［3］，每例样本采集外周血1ml，立即提取单个核细胞后抽提总RNA，并保存相应血清1ml -80℃低温保存备用。

1.2方法 （1）主要试剂和仪器：天根病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（天根）、Taq酶（TAKARA/ C，DR001B）、BigDye Terminatory3.1 Cycle（AB，4336913）、天根乙型肝炎病毒及耐药突变检测试剂盒（天根）、微球（Bio-Rad）、地址序列探针（上海生工）、1.5×TMAC缓冲液（Sigma）、Streptavidin R-phycoerythrin，conjugate（1mg/ml，INVITROGEN）、RNA-DNA嵌合探针（上海吉玛生物）、Rnase A（sigma）、Thermo Spectronic紫外分光光度计（美国Spectronic）、MyCycler PCR扩增仪（Bio-Rad）、Luminex 200（Luminex）、 PCR仪为ABI9700、测序仪ABI3730XL、Light Cycler Real Time PCR扩增仪（Roche）。（2）液体芯片法检测miRNA：将所有标本上PCR仪与嵌合探针进行杂交反应，经过微球杂交、酶切反应、荧光信号检测，以miR-103为内参（取3次读数平均值作为有效内参照数值），将标本的（靶miRNA分子平MFI-对应本底MFI）/（miR-103MFI 对应本底MFI）的比值作为有效数据进行分析。（3）HBV DNA定量测定：PCR反应体系及循环条件为HBV DNA提取液4μl，PCR反应液21μl，42℃5min，94℃5min，（94℃5s，60℃40s）×40cycles，37℃恒温。（4）测序：PCR体系及循环条件为HBV DNA模板2μl、BigDye Mix 2μl、引物（3.2pmol）1μl，96℃1min，（96℃10s，51℃ 10s，60℃ 3min10s）×25cycles，12℃保温。（5）基因分型：用EDTA-酒精纯化PCR产物，用去离子甲酰胺溶解后上3730XL测序并进行分型。

1.3统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。Kolmog orov-Smirnov检验法作数据正态分布检验，数据符合正态分布，计量资料以（x±s）表示，组间统计采用单因素方差分析，计数资料采用χ2检验，将HBV感染后疾病转归的可能相关因素进行多因素Logistic回归分析（累积Logistic模型）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1xMAP液态芯片技术检测各组miRNA结果 见表1。

表1　HBV相关肝病慢性化进展不同时期PBMC中的miRNA的表达结果（x±s）

2.2HBV感染后肝病慢性化演变不同阶段的HBV DNA P基因区点突变及分型结果 见表2及表3。

表2　不同基因型感染的乙肝患者的临床特征［n（%）］

表3　HBV感染相关肝病慢性化进展不同临床阶段P区耐药突变位点及变异方式

2.3HBV感染相关肝病慢性化进展不同临床阶段自发突变位点相关的LAM/ETV耐药情况 见表4。

表4　HBV感染肝病慢性化进展不同时期自发突变位点相关的LAM/ETV耐药情况［n（%）］

2.4HBV感染相关肝病慢性化进程中多因素有序Logistic回归分析 根据单因素方差/卡方检验分析结果剔除变量miR-372、-21、-145、-222、-191（P＞0.05）；将AHB、CHB、LC、HCC这四个HBV感染后肝病慢性化严重程度逐渐加重的不同时期作为应变量Y，为多分类有序变量，其余变量作为协变量，进入Ordinal过程进行单因素Logistic回归分析，剔除变量HBeAg状态、性别、耐药突变（P＞0.05），将其余变量代入Ordinal过程进行多因素Logistic回归分析，得出有统计学意义的影响因素。模型诊断比检验显示回归模型有意义（χ2=355.70，P＜0.05），模型的拟合优度检验（Pearson=379.50，P=1.00），偏差检验（χ2=107.43，P=1.00）显示模型拟合度良好。分析结果表明基因型C、HBV DNA高水平、miR-20a表达上调、miR-126和miR-223表达下调与乙肝的慢性化进展有关。

3　讨论

miRNA是近年来发现的内源性长度为21～25个核苷酸（nt）的一种以序列特异性方式转录后调控基因表达的非编码单链RNA，成熟miRNA可与其他蛋白一起组成RNA诱导的沉默复合体，通过与靶基因mRNA的3'非翻译区以完全互补或不完全互补方式在转录或翻译水平调节相关基因表达，参与发育、增殖、分化、凋亡等多种生物学过程［4］。本研究选用表达稳定的miR-103做内参［5］，以相对定量法对miR-222、-191、-145、-21、-223、-31、-126、-20a、-372做相对定量检测，发现HBV感染相关肝病慢性化进展不同阶段PBMC中miRNA-145、-222、-31、-21、-372表达无统计学差异，提示可能与乙肝慢性演化及致病性无关。HBV感染相关肝病慢性演变过程中miR-20a表达显著上调，NC组表达量最低，HCC组表达最高，且随着慢性化进展其表达量逐渐增高，提示miR-20a的上调不仅参与了乙肝慢性化过程，且可能是乙肝性肝癌一个重要致病性miRNA分子。据报道miR-126在肝脏组织的表达特异性较高［6］，本研究中HBV感染相关肝病PBMC中表达量相对于NC组是下调的，且随着疾病慢性化的进展下调的幅度越大，在HCC组miR-126的表达最低。本研究中miR-223在AHB组表达最高，提示急性感染期miR-223增高可能是一过性的急性反应性增高，从急性感染期进展为CHB、LC及HCC的过程中，其表达逐渐下调，提示miR-126及-223的下调可能与HBV相关肝病慢性化的进展有关。针对HBV相关肝病开展miRNA表达谱的研究，可为HBV急性感染到慢性化发展机制提供一个新的研究角度。

HBV基因型与患者的传播方式、病情进展、临床转归有一定联系，感染后临床转归不仅取决于患者感染时的年龄和免疫力，也与感染病毒株的基因型关系密切。本研究结果的基因型以B和C型为主，在检测的169例标本中未发现其他型别的病毒株。基因型在不同HBV肝病慢性化进展的不同时期的分布具有统计学差异（P＜0.05），随着病情的进展，C基因型的概率越高，提示C基因型可能与乙肝的慢性化进展有关，更易导致患者发生更严重的肝病。乙肝慢性化进展过程是一个机体和病毒多因素相互作用的结果，本研究收集未经过抗病毒治疗的HBV感染者完整的临床信息，结合实验进行多因素Logistic回归分析筛选出HBV DNA载量、基因型和miR-20a、miR-223、miR-126是乙肝慢性化进展的影响因素，推测其可能是HBV感染后慢性化进展为肝硬化至肝癌的推动因素，为探索乙肝的慢性化进展机制、临床预防、治疗、判断预后提供参考。

1 中华人民共和国卫生部.全国人群乙肝血清流行病学调查结果.北京：卫生部,2008.

2 Thakur V,Guptan RC,Kazim SN,et al.Profile,sepectrum and significance of HBV genotypes in chronic liver disease patients in the Indian subcontinent.J Gastroenterology and Hepatol,2002,17（2）：165～170.

3 中华医学会肝病学分会,中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指（2010年版）.中华肝脏病杂志,2011,19（1）：13～24.

4 BartelDP.MicroRNAs：genomics,biogenesis,mechanism,andfunction. Cell 2004,116（2）：281～297.

5 Peltier HJ,Latham GJ.Normalization of microRNA expression levels in quantitative RT-PCR assays：Identification of suitable reference RNA targets in normal and cancerous human solid tissues.RNA,2008, 14： 844～852.

6 Landgraf P,Rusu M,Sheridan R,et a1.A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing.Cell,2007, 129（7）：1401～1414.

HBV genotype xMAP liqued chip miRNA P gene mutation

236800安徽省亳州市人民医院（敖家富 冀文娟张静）

215006苏州大学附属第一医院（顾国浩 蒋敏）

【Abstrat】 Objective To explore the related factors of HBV in the process of its chronic development，and to analyze their roles in the HBV chronic evolution and appraise their value of diagnosis，treatment and prognosis. Methods Establishing the detection Methods of miRNA（miR-191、-223、-222、-145、-21、-31、-126、-20a、-372）in peripheral blood mononuclear cell of HBV infected patients by xMAP bead-based suspension array，and use the technology to detect the expression of miRNA in different HBV infected periods.Using direct sequencing method to detect matching serum sample's HBV genotype and P gene area resistance locus mutation，and analyze gender，age，HBV genotype，HBV DNA load level，gene mutation，miRNA expression level，HBeAg state by Logistic regression analysis，dicuss which related with the disease outcomes after infected HBV and play great roles in the chronic evolution. Results HBV genotype C，the continuous high level expression of DNA loads，miR-20a expression，miR-126 and miR-223 expression were infl uence factors in progress of chronic hepatitis B（P<0.05），while the HBeAg status，natural occurrence of drug resistance related locus mutation，age，gender had no statistical signifi cance（P>0.05）with the chronic progress. Conclusion C genotype，HBV DNA continuous high loads，high expression of miR-20a and low expression of miR-126，-223 maybe the related factors of hepatitis B chronic evolution，especially maybe the liver cancer risk factors.the conventional detect genotype，HBV DNA and miRNA for monitoring，prognosis and timely treatment to prevent chronic hepatitis B developed to LC and HCC provide information.