刘　蓉， 侯　梦， 廖海星， 张新凤， 赵　瑾， 刘宝骅，钱元新， 吴清洪， 莫自耀， 廖东江， 李洪涛， 顾为望

（1. 广州医科大学附属第一医院， 广州 510120； 2. 广州医科大学 呼吸疾病国家重点实验室，广州 510230； 3. 南方医科大学实验动物中心， 广州 510515）

·论著·

西藏小型猪慢性肺动脉高压动物模型的建立

刘蓉1，2， 侯梦1，2， 廖海星1， 张新凤1， 赵瑾1，2， 刘宝骅1，钱元新1， 吴清洪3， 莫自耀1，2， 廖东江1，2， 李洪涛1，2， 顾为望3

（1. 广州医科大学附属第一医院， 广州 510120； 2. 广州医科大学 呼吸疾病国家重点实验室，广州 510230； 3. 南方医科大学实验动物中心， 广州 510515）

目的 采用野百合碱（MCT）诱导方法建立幼龄西藏小型猪慢性肺动脉高压（PH）动物模型，并通过右心导管术和肺脏结构形态进行评价。方法 2月龄西藏小型猪12头， 体质量5.0～6.0 kg。随机均分为实验组（MCT组）和对照组，分别腹腔注射给予MCT 12.0 mg/kg和同样剂量的溶剂（体积分数75%乙醇）； 6周后采用右心导管术测定小型猪肺动脉压； 观察小型猪右心肥大指数和肺组织病理改变。结果 与对照组相比，MCT组西藏小型猪平均肺动脉压显著增加（24.62±1. 38 mmHg vs 15.10±0.76 mmHg，P＜0.01）。肺组织有明显血管堵塞、血管腔消失，也可见肺小血管重构，有肺小动脉闭塞、向心性内膜增厚（丛状血管）的改变。实验组小型猪右心肥大指数增加明显（0.36±0.16 vs 0.28±0.13， P＜0.01）。结论 通过腹腔注射MCT 6 周后，可以建立西藏小型猪慢性PH动物模型，其病理特征与人类PH临床指标相似。

肺动脉高压（PH）； 野百合碱（MCT）； 西藏小型猪； 右心导管术

肺动脉高压（pulmonary hypertension， PH）是一种以肺血管阻力进行性升高、最终导致患者右心功能衰竭为特征的恶性肺血管疾病。临床上肺动脉血压增高的诊断标准为：在海平面状态下，静息时右心导管检查肺动脉收缩压＞30 mmHg （1 mmHg= 0.133 kPa） 和 （或）肺动脉平均压＞25 mmHg，或者运动时肺动脉平均压＞30 mmHg［1-3］。目前其发病机制还不完全清楚，而动物模型的建立是研究其发病机制的主要途径［4］。过去使用较多的为大鼠模型，但由于其体型较小、血流动力学特征差别较大； 其他实验动物如兔［5］、羊［6］和犬［7，8］等模型， 也有相关研究， 但利用超声心动图所获得的PH相关指标有限。为克服这些缺点， 本研究在前期研究基础上［9］选用幼龄小型猪作为造模对象，观察模型动物的表现，以期为临床PH的治疗研究建立一个稳定可靠的动物模型。

1　材料与方法

1.1材料

2月龄普通级西藏小型猪12头，雌雄兼用， 体质量5.0～6.0 kg， 由南方医科大学实验动物中心提供［SCXK粤2011-0015］。动物饲养在南方医科大学实验动物中心普通级设施不锈钢笼具中［SYXK（粤）2011-0074］， 房间温度23～29℃， 相对湿度55%～80%，光照周期12 h/12 h。定期喂食，自由饮水，整个实验过程符合广东省实验动物管理条例的要求。

野百合碱（monocrotaline， MCT）购自成都曼思特生物科技有限公司（HPLC， 99.0%），医用酒精配成25%注射溶液。肝素钠注射液（江苏万邦生化医药股份有限公司）和生理盐水按比例（0.9%氯化钠溶液+ 肝素钠10 U/mL） 混合后， 用注射器吸入一定容量备用。4F心导管（Cordis Corp.， 墨西哥）中充满肝素生理盐水， 导引钢丝也涂上肝素生理盐水。地西泮注射液（天津金耀氨基酸有限公司）每支10 mg/2 mL，戊巴比妥钠（美国Sigma公司）配成3%浓度。

1.2方法

12头西藏小型猪随机均分为对照组和实验组（MCT组）。实验组腹腔注射MCT 12.0 mg/kg，对照组给予约同样体积的溶剂（体积分数75%乙醇）； 给药第3周和第6周采静脉血取血浆备用。给药6周后，采用右心导管术测定每头小型猪肺动脉压。

小型猪肺动脉压测定的具体方法： 打开MedLab生物信号采集处理系统（V6.0， 南京美易科技公司），把心导管和换能器连接起来， 接入三通阀和换能器（换能器和插管中充满肝素生理盐水， 注意不要有气泡）。小型猪经麻醉（地西泮注射液6 mg/kg +戊巴比妥钠溶液10 mg/kg）后仰卧位捆绑在实验用床上，自由呼吸。通过外科手术暴露右颈内静脉约20 mm后， 将5F扩张管和外套管（Cordis Corp.， 墨西哥）置入静脉内， 拔出扩张管，固定外套管。在导引钢丝帮助下，将导管经外套管送入右颈内静脉→前腔静脉→右心房→右心室→肺动脉主干。整个过程均在X光透视条件下进行（Toshiba Medical Systems Corp.，DBX-6000A， 日本），以确保导管端口位于肺动脉主干部位。退出导引钢丝后， 导管连接定标后的压力感受器和MedLab， 自动记录肺动脉收缩压（sPAP）， 肺动脉舒张压（dPAP）和平均肺动脉压（mPAP）。

1.3右心肥大指数测定

于小型猪肺动脉压测完后，采用注射过量麻醉剂和KCl处死小型猪，取小型猪心脏，称量右心室和左心室加中隔重量，计算右心肥大指数即右心室/左心室加中隔重量。同时比较右心室重量/体质量、左心室重量/体质量的比值。

1.4肺脏组织病理学检测

取肺组织固定于质量分数4%的多聚甲醛液中，24 h后经充分水洗，酒精脱水和二甲苯透明后，石蜡包埋，连续切片，切片厚度5 μm。经HE染色后做病理组织形态学检查。

1.5数据统计方法

2　结果

2.1小型猪肺动脉压力测定

MedLab生物信号采集处理系统实时记录了小型猪右心房、右心室和肺动脉压的压力波形，保证了肺动脉压力数据的真实可靠， 如图1、图2所示压力波曲线。与对照组相比，实验组西藏小型猪给药6周后的sPAP （33.97±1.66 mmHg vs 22.99± 1.70 mmHg， P＜0.01）、dPAP（19.94±2.46 mmHg vs 11.32 ±1.07 mmHg， P＜0.01）都有显著增加（表1）。模型组的mPAP与对照组相比也有显著升高（24.62 ±1.38 mmHg vs 15.10 ±0.76 mmHg， P＜0.01）， 压力指标达到临床初级PH的标准。

2.2右心肥大指数

对照组和MCT组小型猪右心肥大指数即右心室与左心室加中隔重量之比，比值有显著性差异（0.28±0.13 和0.36±0.16， P＜0.05）。说明MCT组的右心肥厚比较明显， 与肺动脉压力升高相一致。

图1　西藏小型猪右心房和右心室压力波曲线（右心房→右心室）Figure 1 The pressure curve of Tibet minipigs at the right atrium and the right ventricle

图2　西藏小型猪正常肺动脉压力波曲线（右心室→肺动脉）Figure 2 Pulmonary artery pressure curve of Tibet minipigs in control group

表1　西藏小型猪给予MCT 6 周后肺动脉压力变化Table 1 Pulmonary artery pressure of pigs at six weeks after MCT injection mmHg

图3　各组小型猪肺组织形态学观察Figure 3 Morphology of pulmonary tissues of the minipigs （HE staining）

2.3病理学改变

MCT组肺小动脉内皮细胞、平滑肌细胞增生肥大， 血管内膜纤维化增厚伴玻璃样变， 管腔狭窄，闭塞，扭曲变形，呈丛状改变； 肺小静脉可见内膜纤维性增生和管腔阻塞（图3A）； 肺小血管重建，肺小动脉管壁增厚，有肺小动脉闭塞、向心性内膜增厚（丛状血管）的改变（图3B）； 肺动脉血管明显增厚，狭窄， 部分管壁厚薄不均（图3C）； 支气管旁的血管（图3D），左边动脉血管，管腔狭窄，内皮细胞增生，血管壁明显增厚，玻璃样变； 右边为静脉管壁，同样增厚并发生玻璃样变从而导致管腔狭窄。

3　讨论

MCT属双稠吡咯啶生物碱，对癌细胞DNA可发生烃化作用而起到抗癌作用，体内注射后主要分布于肝、肾和胃，对多种实验性肿瘤有抑制作用。在实验室MCT广泛用于PH疾病模型的复制，以大鼠使用较多［10］； 近年来兔、羊和犬也都成功地复制了PH动物模型，尽管方法不尽相同，在血流动力学方面与临床特征均较为接近。但根据病理分析和后续的药物治疗研究显示，与临床表现和治疗情况反差很大［4］，因此探索建立新的与临床相近的动物模型显得非常必要。猪的肺脏血管床结构、呼吸频率、潮气量和体型大小等方面与人类极为相似，因此近年来小型猪也常用于PH模型复制和研究［11，12］。但仅限于急性模型的复制，复制方法包括利用低氧［13］或低压低氧［14］的方法，以及结扎单侧肺动脉［11］或经气管内吸入胎粪法建立急性模型［15］，而且较多使用幼猪（5～10 kg）或新生猪来建立急性PH模型［16］。

陈洪茂等［5］曾开展了利用MCT诱导西藏小型猪建立PH动物模型的研究， 效果较好。但所用的是4～5月龄成年小型猪存在一些缺点， 如实验后期体型相对偏大，动物固定和操作难度大， 用药量也大，同时周期偏长（8周）。为克服以上缺点， 考虑到幼龄动物对药物的敏感性更高，利用2月龄西藏小型猪来建立模型，结果显示肺动脉压力波形与临床变化一致， MCT腹腔注射给药第6周，肺动脉压升高明显， mPAP由15.10 ± 0.76 mmHg 升至24.62 ± 1.38 mmHg， 可以确定6周时间即形成PH， 与之前实验结果［9］基本一致， 但实验周期缩短。

右心肥大指数显示， 小型猪给予MCT（12.0 mg/kg）6周后， 实验组的右心肥大指数有显著增加（P＜0.05）。说明右心肥厚比较明显，与肺动脉压力升高的结果相一致。实验组小型猪肺脏结构的病理改变，显示肺脏重构情况明显，除了有肺小动脉管腔扭曲变形、狭窄、闭塞以外，也可见到向心性内膜增厚（丛状血管）的改变； 支气管旁的血管，不仅动脉血管有管腔狭窄、内皮细胞增生、血管壁明显增厚，静脉管壁同样增厚并发生玻璃样变从而导致管腔狭窄。从病理改变情况可以认为该模型的病理变化与人类临床动脉性PH的病理改变一致。同时也验证了幼龄小型猪正处于生长发育期，对于药物比较敏感，反应强烈，结构变化比较快，容易出现病理结构的改变。

利用西藏小型猪建立慢性PH动物模型，除指标接近临床特征外，由于其心肺血管结构与人体高度相似，其血流动力学指标的测定完全可以利用临床设备进行， 结果也与人体最为接近， 同时作为慢性疾病模型，可以进行长期的观察和药物治疗研究。总之，通过MCT诱导建立西藏小型猪慢性PH动物模型，方法简便易行，成功率较高，可以为慢性PH的基础和临床研究提供了一个良好平台。

［1］Barst RJ， McGoon M， Torbicki A， et al. Diagnosis and differential assessment of pulmonary arterial hypertension ［J］. J Am Coll Cardiol， 2004， 43：40S-47S.

［2］Simonneau G， Robbins IM， Beghetti M， et al. Updated clinical classification of pulmonary hypertension［J］. J Am Coll Cardiol， 2009， 54：S43-S54.

［3］Galie N， Hoeper MM， Humbert M， et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension： the task force for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension of the European society of cardiology （ESC） and the European respiratory society （ERS）， endorsed by the International society of heart and lung transplantation （ISHLT）［J］. Eur Heart J， 2009， 30：2493-2537.

［4］Stenmark KR， Meyrick B， Galie N， et al. Animal models of pulmonary arterial hypertension： the hope for etiological discovery and pharmacological cure［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2009， 297（6）：L1013-1032.

［5］陈洪茂， 段云友， 周宁， 等. 实时超声监测兔慢性肺动脉高压模型的建立及其意义［J］. 中国超声医学杂志， 2008， 24 （8）：864-867.

［6］Ichinose F， Erana-garcia J， Hromi J， et al. Nebulized sildenafil is a selective pulmonary vasodilator in lambs with acute pulmonary hypertension ［J］. Crit Care Med， 2001， 29（5）：1000-1005.

［7］Schober KE， Baade H. Doppler echocardiographic prediction of pulmonary hypertension in West Highland white terriers with chronic pulmonary disease［J］. J Vet Intern Med， 2006，20（4）： 912-920.

［8］Chen EP， Bittner HB， Tull F， et al. An adult canine model of chronic pulmonary hypertension for cardiopulmonary transplantation［J］. J Heart Lung Transplant， 1997， 16（5）：538-547.

［9］赵瑾， 刘蓉， 李洪涛， 等. 野百合碱诱导肺动脉高压小型猪的病理改变［J］. 南方医科大学学报， 2012， 32（6）：867-869.

［10］ 陈莉延， 麦奇， 彭勃， 等. 白藜芦醇苷对慢性常压低氧性肺动脉高压模型中磷脂酶A_2、一氧化氮和内皮素水平的影响［J］. 中国病理生理杂志， 2006， 22（5）：953-955.

［11］ Rosenkrantz JG， Carlisle JH， Lynch FP， et al. Ligation of a single pulmonary artery in the pig： a model of chronic pulmonary hypertension［J］. J Surg Res，1973， 15（1）：67-73.

［12］ Berg R， Pehlemann K. Anatomic studies of the pulmonary hypertension syndrome in the domestic pig［J］. Anat Histol Embryol， 1987， 16（3）：265-270.

［13］ Owall A， Davilén J， Sollevi A. Influence of adenosine and prostacyclin on hypoxia-induced pulmonary hypertension in the anaesthetized pig［J］. Acta Anaesthesiol Scand， 1991， 35 （4）：350-354.

［14］ 李娟， 孙新， 毕辉， 等. 低压低氧性大鼠肺动脉高压模型的建立［J］. 临床心血管病杂志， 2008， 24（4）： 297-301.

［15］ Mutschler D， Wikström G， Lind L. Etanercept reduces late endotoxin-induced pulmonary hypertension in the pig［J］. J Interferon Cytokine Res， 2006， 26（9）：661-667.

［16］ 吴忠仕， Susan M. HALL， Sheila G. HAWORTH， 等. 新生乳猪缺氧性肺动脉高压的肺血管重构［J］. 湖南医科大学学报， 2002， 27 （2）：114-116.

Establishment of Chronic Pulmonary Hypertension Model in Tibet Minipig

LIU Rong1，2， HOU Meng1，2， LIAO Hai-xing1， ZHANG Xin-feng1， ZHAO Jin1，2， LIU Bao-hua1， QIAN Yuan-xin1，WU Qing-hong3， MO Zi-yao1，2， LIAO Dong-jiang1，2， LI Hong-tao1，2， GU Wei-wang3
（1. Affiliated First Hospital of Guangzhou Medical University， Guangzhou 510120， China；2. The State Key Laboratory of Respiratory Diseases， Guangzhou Medical University， Guangzhou 510230，China； 3. Laboratory Animal Centre， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China）

Objectives To establish chronic pulmonary hypertension （PH） model with monocrotaline （MCT） in young Tibet minipigs. Methods Twelve Tibet minipigs （weighing 5.0～6.0 kg， aged 2.0 months）were randomly divided into two groups and treated with MCT （12.0 mg/kg） or placebo （75% ethanol）. After six weeks， the pulmonary arterial pressures of the minipigs were measured by performing right heart catheterization （RHC）. The pathologic changes of small pulmonary arteries were observed. Index of right ventricular hypertrophy was also compared between two groups. Results The mean pulmonary arterial pressure by RHC was obviously increased in the MCT group than that in control group （24.62±1.38 mmHg vs 15.10±0.76 mmHg， P＜0.01）. The pathologic observations showed that the pulmonary vascular remodeling and the lumen disappeared in small pulmonary arteries. There was also progressive intimal fibrosis accompany with hyalinization， the lumen was occlusive， twisty and distorted with plexiform lesions. Indexes of right ventricular hypertrophy of MCT group were significantly higher （0.36±0.16 vs 0.28±0.13， P＜0.05）. Conclusions An animal model of chronic PH was established successfully in young minipigs at six weeks after MCT was intraperitoneally injected. The features of the chronic PH model of minipigs are similar with the primary PH parameters.

Pulmonary hypertension； Monocrotaline（MCT）； Tibet minipig； Right heart catheterization

Q95-33

A

1674-5817（2015）06-0431-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.001

2015-06-29

国家973项目（2011CBA01006）； 广东省科研基础条件建设项目（2012B060300032）

刘蓉（1976-）， 女， 硕士研究生。E-mail： lrong2007@163.com

李洪涛， 男， 医学博士， 教授， 研究方向： 呼吸病理生理学。 E-mail： gyhongtao@126.com顾为望， 男， 教授， 博士生导师， 研究方向： 比较医学。E-mail： Guww100@163.com