齐君++夏雪奎++刘新++袁文鹏++张永刚++贾爱荣++刘昌衡

摘 要：目的：对一株海参来源的链格孢属真菌 （Alternaria sp.） 的次级代谢产物进行研究。方法：利用大米培养基对该菌进行发酵培养，通过薄层层析、柱层析、高效液相等分离手段，从链格孢属真菌 （Alternaria sp.） 的乙酸乙酯提取物中分离获得4个化合物。结果：利用质谱和核磁共振等现代波谱分析方法，依次鉴定为：麦角甾-4，6，8（14），22-四烯-3-酮（1），麦角甾-6β-羟基-4，7，22-三烯-3-酮（2），Alternariol（3）和Alternariol methyl ether（4）。

关键词：海参来源真菌 Alternaria sp. 次级代谢产物

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2015）07（a）-0002-02

海参属于海洋低等无脊椎动物中的棘皮动物门（Echinodermata）海参纲（Holothurioidea），是一种名贵的海洋动物，其营养丰富，是典型的高蛋白、低脂肪食物，其中的海参黏多糖、海参素、海参皂苷、氨基酸、多肽等活性成分，具有提高机体免疫力、抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤等多种生理功能[1]。海参共附生微生物与其长期共存，共同抵御海洋特殊的生态环境，在生态系统的进化过程中与海参之间形成了良好的共生关系，能够产生化学结构多样、生物活性显著的次级代谢产物，在活性天然产物的研究中有着巨大潜力[2-3]。本课题组已经从海参来源的真菌中发现了结构新颖的、具有细胞毒活性的二萜类化合物，具有抑制血管生成活性的苯并呋喃类化合物，以及具有多种生物活性的聚酮类化合物[4-6]。本研究对一株海参来源的链格孢属真菌 （Alternaria sp.） HS-7的次级代谢产物进行了研究，通过薄层层析、柱层析、高效液相等分离手段，分离获得4个化合物，经质谱和核磁共振等现代波谱分析，鉴定为：麦角甾-4，6，8（14），22-四烯-3-酮（1），麦角甾-6β-羟基-4，7，22-三烯-3-酮（2），Alternariol（3）和Alternariol methyl ether（4）。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

SW-CJ-1FD型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；THZ-C型恒温震荡培养箱，江苏太仓市实验设备厂；Waters 高效液相色谱系统（美国Waters公司）；安捷伦QTOF 6530液质联用仪；超导核磁共振仪 INOVA；石油醚，乙酸乙酯，二氯甲烷等为分析纯，甲醇为色谱纯（天津化学试剂厂）；柱层析硅胶（200目～300目），薄层硅胶GF254（青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20。

1.2 菌种来源

菌株HS-7采集自威海成山头海域的海参表皮分离得到，目前保存在山东省科学院生物研究所食品生物技术研究室。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分离

将海参用无菌水清洗3次去除表面泥沙后，在海参各个部位分别切取小块，然后用组织切片法和组织匀浆法进行共附生微生物的分离。放入28℃培养箱中倒置培养，采用平板划线法挑取单菌落将其转接到另一新的平板上，进行反复的划线，获得纯的菌株。

1.3.2 菌株的发酵

从原始保藏菌种管中转接到平板进行复活，确定菌株纯化后，将菌种接取适量到 PDA液体培养基中，摇床培养2～3天，制备种子培养基。取种子培养液接入到大米培养基（120g/200mL海水，121℃，20min 高温灭菌），发酵20瓶，在室温下培养28天。

1.3.3 浸膏的制备和分离纯化

发酵28天后，用3倍体积的乙酸乙酯浸泡提取大米培养基发酵物，减压浓缩得到乙酸乙酯相浸膏（4.5g）。乙酸乙酯相浸膏经反复的正相硅胶柱层析、凝胶柱层析以及半制备HPLC等方法分离得到4个化合物。

2 结果与讨论

化合物1易溶于氯仿，1HNMR谱图显示甾体化合物的特征，1HNMR（CDCl3， 400MHz）δ：6.61（1H，d，J=9.6Hz，H-7）， 6.04（1H，d，J=9.6Hz，H-6），5.74（1H， s，H-4），5.23（2H，m，H-22，H-23），1.06

（3H，d，J=6.8Hz，H-21），1.00（3H， s，H-19），0.96（3H，s，H-18），0.93（3H，d，J=6.8Hz，

H-28），0.85（3H，d，J=6.8Hz，H-27）， 0.83（3H，d，J=6.8Hz，H-26）。通过与文献数据[7]的比较确定其结构为麦角甾-4，6，8 （14），22-四烯-3-酮。

化合物2：1HNMR（CDCl3，600MHz） δ：6.12（1H，d，J=2.2Hz，H-4），5.14-5.25 （3H，overlapped，H-7，H-22andH-23），

4.97（1H，brs，H-6），1.18（3H，s，H-19），

1.03（3H，d，J=6.6Hz，H-21），0.92（3H，

d，J=6.6Hz，H-28），0.84（3H，d，J=6.6Hz，

H-27），0.82（3H，d，J=6.6Hz，H-26）， 0.61（3H，s，H-18）。通过与文献数据[8]的比较确定其结构为麦角甾-6β-羟基-4，7， 22-三烯-3-酮。

化合物3：1HNMR（DMSO，600MHz）δ：11.77（1H，s，2-OH），11.09（1H，brs，

4-OH），10.42（1H，brs，10-OH），7.26（1H，d，

J=1.8Hz，H-5），6.72（1H，d，J=2.4Hz，H-7），endprint

6.65（1H，d，J=2.4Hz，H-9），6.38（1H，d，J

=1.8Hz，-H-3），2.71（3H，s，8-Me）；13CNMR（DMSO，150MHz）δ：165.9（C，C-13），

165.1（C，C-4），164.5（C，C-2），158.9（C，C

-10），153.0（C，C-12），138.7（C，C-8），138.5

（C，C-6），118.0（C，C-11），109.4（CH，C-7），

104.7（CH，C-9），102.0（CH，C-5），101.3（C，

C-1），97.8（CH，C-3），25.6（CH3，8-Me）；ESIMS[M-H]-m/z257.2。经过与文献数据[9-10]比对，确定化合物为Alternariol。

化合物4：1HNMR（DMSO，600MHz）δ：7.14（1H，d，J=1.8Hz，H-5），6.65（1H，

d，J=1.8Hz，H-7），6.54（1H，d，J=1.8Hz，

H-9），6.52（1H，d，J=1.8Hz，H-3），3.89（3H，

s，4-OMe），2.70（3H，s，8-Me）；ESIMS [M-H]-m/z271.2。经过与文献数据[9-10]比对，确定化合物为Alternariol methyl ether。

3 结论

通过对海参来源的链格孢属真菌 （Alternariasp.） HS-7次级代谢产物的研究，得到4个次级代谢产物。分别为麦角甾-4，6，8（14），22-四烯-3-酮（1），麦角甾-6β-羟基-4，7，22-三烯-3-酮（2），Alternariol（3）和Alternariol methyl ether（4）。其中化合物1和2均为首次从海参来源的真菌中分离得到。研究已证实麦角甾酮具有利尿、抗肿瘤、免疫抑制、治疗慢性肾脏病等多种生物活性[7]，为海洋药物先导化合物的发现提供了新资源。海参共附生微生物的研究为深入开发海参资源奠定了基础，提供了新思路。

参考文献

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