施文骁，顾雪迎，郭庆元*，王洪凯*

（1.浙江大学 生物技术研究所，浙江 杭州 310058；2.新疆农业大学 农学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

环介导扩增快速检测葡萄根癌病菌技术体系的建立

施文骁1，顾雪迎2，郭庆元2*，王洪凯1*

（1.浙江大学 生物技术研究所，浙江 杭州 310058；2.新疆农业大学 农学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

葡萄根癌病是葡萄上的重要病害之一。设计适用于葡萄根癌病菌环介导扩增的特异性引物，并建立快速检测葡萄根癌病菌的环介导扩增检测体系。

葡萄根癌病；环介导同温扩增；快速检测

文献著录格式：施文骁，顾雪迎，郭庆元，等.环介导扩增快速检测葡萄根癌病菌技术体系的建立 ［J］.浙江农业科学，2015，56（12）：2015-2018.

葡萄根癌病是世界范围内葡萄种植区的一种严重病害，为害葡萄后，在葡萄的根茎部位形成粗大的癌肿是其典型的症状［1-2］。关于引起葡萄根癌病的病原，目前全世界报道有2种，Agrobacterium vitis和A.rhizogenes。来自分子和脂肪酸的研究表明，A.vitis和A.rhizogenes的亲缘关系很近［3］。但大量试验确认，葡萄根癌病的主要病原菌是A. vitis［1］。在我国，葡萄根癌病菌是A.vitis，此种细菌主要生活在根冠及周围的土壤中，可以在葡萄藤上存活并繁殖，能引起葡萄产量的下降甚至整株葡萄的枯死［1-2］。

快速准确检测是植物病害有效防治的基础。以PCR技术为基础的快速检测方法，已经广泛应用到植物病原菌的检测中［1］。葡萄根癌病是土传病害，因而对苗木、植株进行早期检测，从源头上减少带菌植物，是防治此病害的最直接的方法。目前，基于PCR方法的快速检测体系［4-5］，如特异性引物PCR检测、荧光定量PCR检测体系，已经相继建立［6-8］。但这些方法一般需要比较昂贵的仪器设备，往往还需要电泳等辅助方法，费时费力［9］。环介导扩增方法技术简单，扩增过程温度一致，不需要变温，时间短，特异性高，容易成为普及的快速检测方法［10-11］。本研究利用从新疆吐鲁番地区分离到的Agrobacterium vitis菌株，建立了环介导扩增快速检测葡萄根癌病菌的技术体系。

1　材料与方法

1.1供试菌株

葡萄根癌病致病菌株A-1，A-2，A-3，A-4（由新疆农业大学，郭庆元教授提供），及标准菌株AV1.2555（中国科学院微生物研究所菌种保藏中心提供）。发根农杆菌菌株AGL1由浙江大学生物技术研究所真菌研究室保藏，作为对照。

1.2葡萄根癌病菌的分子鉴定

根据国际上对葡萄根癌病的研究结果，获得用于检测葡萄根癌病的7对引物，引物序列见表1。

表1　用于PCR检测的特异性引物

菌体培养、DNA的提取方法按照文献 ［7］的方法进行。PCR程序根据引物的不同，采用文献中介绍的程序进行。

1.3环介导等温扩增技术

1.3.1环介导等温扩增的引物设计

在 LAMP引物设计的网站 （http：// primerexplorer.jp/e/）上，将目的DNA片段序列按照提示上传，设计引物，选取在特异性序列位置的LAMP引物作为合适的引物序列。

1.3.2环介导等温扩增的体系建立

为了建立对葡萄根癌病最好的LAMP检测反应体系，在LAMP的一般检测体系的基础上分别对其引物浓度，Mg2+浓度，Bst酶量，反应温度，反应时间等条件进行优化。具体试验如下：引物FIP/ BIP/F3/B3的加入量设为3/3/0.25/0.25，2.5/ 2.5/0.25/0.25，2/2/0.25/0.25，3/3/0.5/0.5（单位为μL），4个梯度；2.5 mmol.L-1Mg2+的加入量为4，5，6和 7μL；Bst酶加入量分别为1.2，1.0，0.8，0.6和0.5 U；将反应中加入的DNA浓度分别稀释至10-1，10-2，10-3，10-4倍；反应温度设置为55，58，60，63，65℃；反应时间分别设置为30，45，60，90，120 min。通过上述6次试验来确定适用于葡萄根癌病菌的LAMP检测反应体系。

1.4田间样品的快速检测

将田间的病瘤组织切取3 mm×3 mm×3 mm的小块，置入200μL无菌水中，浸泡10 min。然后去掉组织块，将病菌浸出液在95℃加热5 min，取2μL为模板，进行环介导同温扩增。以健康的葡萄组织为对照。

2　结果与分析

2.1葡萄根癌病菌的特异性DNA片段筛选

葡萄根癌病菌不同菌株之间存在遗传分化。根据以前的研究，根据不同的DNA片段，已经有7对特异性引物用于不同时间和地点的葡萄根癌病菌的分子鉴定。为了明确哪个DNA片段适合我们采集到的菌株的检测，我们分别以病原菌株A-1，A-2，A-3，A-4，及标准菌株AV1.2555的DNA为模板，用查阅到的7对PCR引物进行PCR验证。其结果如图1所示。仅VirFF1/VirFR2能够扩增出单一清晰的条带，AVSP3-1F/AVSP3-1R和AVSNP-3F/AVSNP-3R均未能扩增出条带，PGF/PGR，NOPFa/NOPRa，Ab3-F3/Ab3-R4和VCF3/VCR3有部分不能扩增出条带，能扩出的条带也不清晰或单一。

图1　葡萄根癌病病原菌鉴定引物筛选的结果

引物对VirFF1/VirFR2对应的DNA片段是Agrobacterium vitis VirF（virF）gene（GenBank No. AF044200）。

2.1.1环介导等温扩增技术

登录 LAMP引物设计网站 （http：// primerexplorer.jp/e/），导入目的DNA片段序列，自动生成引物组。挑选引物正好在病原菌的特异性序列处的引物组 （表2、图2）。

表2　LAMP特异性引物的序列

图2　LAMP引物扩增序列及6个特异性区域

在LAMP检测体系中，引物浓度是其主要的影响因素之一，外引物浓度过高会抑制内引物结合到模板上的起始扩增速率，而浓度过低则会导致反应不完全。Mg2+是酶开始反应的启动因子，影响LAMP整个反应过程的效率。Bst DNA聚合酶是一种具有自主链置换活性的DNA聚合酶，该酶是使LAMP反应能够在恒温条件下进行的关键之一，而该酶的活性又直接决定反应的效率。Bst DNA聚合酶的最适反应温度为60～65℃，因此LAMP的反应温度应设置在此区间内。

因此在本研究中对LAMP反应条件的优化实验结果表明，葡萄根癌病LAMP反应的最佳体系为内外引物比10∶1，即FIP/BIP/F3/B3为2.5/2.5/ 0.25/0.25，其余条件皆与文献提供一致。电泳结果如图3所示。

图3　LAMP最佳反应体系的电泳图

LAMP利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下能够特异、高效、快速地扩增DNA，能够在极低的目的片段拷贝数下发生扩增反应。为了检测LAMP技术的灵敏度，本研究将病原菌DNA按10的倍数稀释5个梯度进行反应，反应结果显示，LAMP体系的检测灵敏度可达20 pg。

因此，我们建立的LAMP检测体系为 （25μL）：10×Bst缓冲液2.5μL，Mg2+（2.5 mmol.L-1）6μL，F3/B3（20μmol.L-1）各0.25μL，FIP/ BIP（20μmol.L-1）各3μL，dNTP（10 mmol. L-1）3.5μL，ddH2O 4.5μL，1 U.μL-1Bst DNA聚合酶1μL，DNA 1μL。62℃反应1 h。

2.1.2田间样品的快速检测

将田间样品进行LAMP反应，通过电泳观察，在病组织样品中检测到病菌，而在健康组织中，没有扩增出产物，得到如下结果 （图4）。

将扩增以后的离心管进行10 000 r.min-1离心，可观察到离心管底部有白色沉淀产生。取5μL LAMP反应液，加入45μL的稀释10倍SYBR®GREENⅠ荧光染液，可以观察到阳性反应液变成绿色，而阴性反应液只起到稀释荧光染液的作用 （图5）。

图4　LAMP田间样品检测的电泳图

图5　LAMP田间样品荧光染色图

3　小结与讨论

葡萄根癌病是威胁葡萄安全生产的严重病害［2］，建立快速高效的检测体系有利于对该病害的有效防控。

葡萄根癌病菌还可以侵染其他植物，如长寿花、向日葵、番茄、曼陀罗、烟草、灰藜等，但不同菌株的寄主范围有差别，对检测引物的反应也有不同，说明种内存在明显的遗传分化［12］。因此，需建立适合于葡萄栽培地的病菌菌株检测体系。本研究根据田间采集到的菌株，建立了适合当地菌株的等温环介导扩增的方法，该方法体系不需要复杂的仪器设备，只要一个62℃的保温器皿及一个简单的紫外灯，即可在60～90 min内完成整个检测过程。目前LAMP技术检测葡萄根癌病的体系虽然已经建立，但是田间试验还相对偏少，今后应结合实际应用进一步优化，从而使其能更有效、更可靠地运用于实际检测中。

［1］ 施文骁，王洪凯，郭庆元.葡萄根癌病研究进展 ［J］.浙江农业科学，2013（11）：1418-1421.

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（责任编辑：张 韵）

S 436.631

A

0528-9017（2015）12-2015-03

10.16178/j.issn.0528-9017.20151231

2015-07-01

新疆维吾尔自治区重大项目 （201130102）

施文骁（1990-），女，浙江杭州人，硕士研究生。E-mail：Zjwxshi@gmail.com。

郭庆元。E-mail：guoqingyuan3009@sina.com；王洪凯。E-mail：hkwang@zju.edu.cn。