弓 宝，陈德力，刘洋洋，方 草，王德立，杨新全*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 海南分所，海南 万宁 571533；2.海南省农垦总医院，海南 海口 570311)

·基础研究·

牛大力根油脂抗氧化活性研究△

弓 宝1，陈德力1，刘洋洋1，方 草2，王德立1，杨新全1*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 海南分所，海南 万宁 571533；2.海南省农垦总医院，海南 海口 570311)

目的：研究牛大力根油脂抗氧化活性。方法：将牛大力根干燥粉末用70%乙醇浸提，结合硅胶柱层析分离，获得牛大力根油脂提取物F-1和F-2，同时采用加热回流法提取获得牛大力根油脂提取物F-3，并以DPPH法和FRAP法对各油脂提取物的抗氧化活性进行评价。结果：在DPPH法中，F-1、F-2及F-3的半数最高抑制浓度(IC50)值分别为203.18、138.38、244.10 μg·mL-1，其FRAP值分别为(7 712.2±274.7)、(10 387.5±280.5)、(4 584.1±182.3) μmol Fe2+·g-1。抗坏血酸(Vc)和BHT的IC50值分别为11.59、53.69 μg·mL-1，FRAP值分别为(17 356.1±622.9)、(13 235.4±469.5) μmol Fe2+·g-1。结论：牛大力根油脂具有一定的抗氧化活性，且以F-2最强。

牛大力；油脂；抗氧化

牛大力为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤MillettiaspeciosaChamp.的根，别名猪脚笠、山莲藕、大力薯、大力牛等[1]，以根入药，载于《陆川本草》，全年可采。牛大力具有补虚润肺、强筋活络的功效，可用于治疗腰肌劳损、风湿性关节炎、肺热、肺虚咳嗽、肺结核、慢性支气管炎和慢性肝炎、病后体虚等病症[2]。在广东、广西、海南等地还广泛用作煲汤原料，可补腰肾、强筋骨，为岭南地区著名的药食两用植物。

目前，国内外学者对牛大力根及叶化学成分的研究表明，牛大力中含有三萜皂苷、异黄酮、查尔酮、多糖、香豆素、生物碱等类成分，具有抗氧化、增强免疫力、抗炎、抗肿瘤、祛痰平喘等活性，是一味具有多种药理作用和良好保健功效的南药[3-6]。目前，未见牛大力根油脂抗氧化活性的研究报道。据此，本文对牛大力油脂的抗氧化活性进行了研究，为牛大力资源的综合开发利用提供科学依据，本项目组对牛大力根的脂溶性成分进行了提取与分离富集，并采用DPPH法和FRAP法对其进行体外抗氧化活性评价，为进一步研究和开发利用牛大力奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 材料

实验用牛大力根，于2013年10月采自海南省五指山参毛阳镇，经中国医学科学院药用植物研究所海南分所冯锦东研究员鉴定为MillettiaspeciosaChamp.的根。采后晒干粉碎，放置干燥暗处贮存备用。

2，2-二苯基-1-苦基苯肼(DPPH，A Johnson Matthey Company)，2，6-二叔丁基对甲酚(BHT，广州化学试剂厂，分析纯)，2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ，Sigma)，抗坏血酸(Vc)、无水醋酸钠、无水醋酸、FeCl3·6H2O、盐酸(广州化学试剂厂，AR)，石油醚、乙酸乙酯、乙醇、正丁醇、二甲基亚砜(DMSO)、95%乙醇均为分析纯。

1.2 仪器

xMARK微孔板分光光度计(美国BIO-RAD公司)、BT224S电子天平(德国Sartorious公司)，移液器(20 μL、200 μL，DRAGON-MED)。

2 方法

2.1 试样的制备

牛大力根干燥粉末2.5 kg，用70%乙醇水溶液(10 L × 3)室温提取7 d，减压浓缩至无醇味，得浸膏250 g。将所得浸膏分散于水中成悬浊液，以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，减压浓缩得石油醚萃取物10 g。取石油醚萃取物，硅胶柱色谱(200～300 目，40 g)干法上柱，以石油醚-乙酸乙酯(99∶1)梯度洗脱，采用TLC 检测合并相同馏分，得到12个部位，其中F-1(550 mg)和F-2(1.472 8 g)为脂溶性成分，溶解于DMSO，过滤，备用。

取200 g牛大力根干燥粉末，置于2 L烧瓶中，加入1000 mL石油醚，70 ℃加热回流萃取4 h，取萃取液过滤，减压浓缩，得到脂溶性成分F-3(2.565 4 g)，溶解于DMSO，过滤，备用。

精确称取F-1、F-2及F-3各10 mg，溶解于10 mL DMSO溶液中，制成1 mg·mL-1的母液试样，置4 ℃冰箱保存备用，实验时配制成500、450、400、350、300、250、200、150、100、50、10 μg·mL-1的样品溶液。

2.2 阳性对照品溶液的制备

准确称取100 mg抗坏血酸(Vc)，用蒸馏水溶解并定容至100 mL容量瓶中，即得1 mg·mL-1抗坏血酸的母液，再稀释配制质量浓度分别为40、30、20、10、5、1 μg·mL-1的样品溶液。

准确称取100 mg BHT，用蒸馏水溶解并定容至100 mL容量瓶中，即得1 mg·mL-1BHT的母液，再稀释配制质量浓度分别为100、80、60、40、20、10 μg·mL-1的样品溶液。

2.3 DPPH自由基清除试验

参照文献[7-8]的方法，进行改进优化。在96孔板中按表1加样，分别在517 nm处测定Ao、Ai、Aj在30 min后的吸光度，每一个试样做3个平行样，取平均值。按公式计算样品对自由基的清除率。并采用药物代谢动力学模型拟合，计算不同样品在对DPPH清除率为50%时的浓度(即IC50)，对不同溶剂提取的样品抗氧化能力进行评价，即IC50越小，抗氧化能力越强。

清除率(%)=(1-)×100% (1)

注：Ao，DPPH溶液反应前的吸光值；Ai，样品与DPPH溶液反应后的吸光值；Aj，空白对照的吸光值。

2.4 FRAP试验

2.4.1 绘制标准曲线 吸取2.5 mL系列浓度为25、100、 150、200、400、500、800、1000、1500 μmoL·L-1的硫酸亚铁(FeSO4)溶液，与2.5 mL 10 mmol·L-1TPTZ溶液、25 mL 300 mmol·L-1醋酸-醋酸钠缓冲液(pH3.6)混合，再分别吸取该混合液200 μL加入96孔酶标板中，放入 x-Mark酶标仪内，升温至37 ℃，于593 nm下读取吸光值。以FeSO4溶液的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，所有试验重复3次。

2.4.2 试样抗氧化活性测定 参照文献[7，9-10]的方法，即吸取2.5 mL 20 mmol·L-1FeC13溶液，与2.5 mL 10 mmol·L-1TPTZ溶液、25 mL 300 mmol·L-1醋酸-醋酸钠缓冲液(pH3.6)混合，再吸取该混合液150 μL加入96孔酶标板中，放入xMark酶标仪内，升温至37℃，于593 nm下读取反应前吸光值A1(TPTZ本身有颜色)，之后在孔中加入50 μL 1 mg·mL-1的待测抗氧化物质。30 min后于593 nm处读取反应后吸光值A2。由(A2-A1)的值在标准曲线上获得抗氧化物质相应的FeSO4的浓度(μmol·L-1)，再转换成量纲为μmol·g-1，定义为FRAP值。FRAP值越大，表明由抗氧化物质还原的Fe2+越多，即抗氧化物质的抗氧化活性越强。所有的试验重复3次。

2.5 数据分析

3 结果

3.1 清除DPPH自由基能力

DPPH 在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，具有单一电子，在波长为517nm 下具有最大吸光值，有自由基清除剂存在时，DPPH 的单电子被捕捉而使其颜色变浅，是有效评价抗氧化活性的体外模型之一。

以抗坏血酸及BHT为阳性对照组，其与自由基反应30 min后的最终清除率对样品质量浓度作图，采用药物代谢动力学函数拟合，结果见图1，计算得Vc的IC50=11.59 μg·mL-1(r=0.994 4)；BHT的IC50=53.69 μg·mL-1(r=0.995 5)，具有很好的相关性。

图1 Vc和BHT对DPPH自由基清除率曲线

以提取、分离纯化所得牛大力根油脂样品对DPPH的最终清除率与质量浓度作图，采用药物代谢动力学函数模型进行拟合，并计算其IC50值，结果如图2所示。

图2 不同样品质量浓度与其最终清除率的关系图

由图2可以看出，牛大力根油脂F-1的IC50值为203.18 μg·mL-1(r=0.998 8)，F-2的IC50值为138.38 μg·mL-1(r=0.996 4)，F-3的IC50值为244.10 μg·mL-1(r=0.999 6)。比较可知，F-2对自由基DPPH的清除效果较好，其次分别为F-1、F-3。

3.2 FRAP值测定结果

Fe3+吡啶三吖嗪可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出蓝色，并于593 nm 处具有最大吸收值，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱，FRAP值越大，抗氧化活性越强。由图3可以看出，5种不同样品均表现出一定的还原力，以Vc最为显著，FRAP值为(17 356.1 ± 622.9) μmol Fe2+·g-1，其次为BHT、F-2、F-1及F-3，FRAP值分别为(13 235.3±469.5)、(10 387.5±280.5)、(7 712.2±274.7)、(4 584.1±182.3) μmol Fe2+·g-1。

注：不同小写字母表示具有统计学差异。图3 不同样品铁离子还原能力图

由于不同抗氧化检测方法的反应机理不同，为获得可靠的结论，以样品的IC50和FRAP值为指标进行统计分析，比较DPPH法与FRAP法的相关性，发现两种方法的结果具有很好的线性关系(r=0.971)，说明此两种方法的结果具有很好的相关性和一致性。因此，IC50和FRAP值可视为样品观测的2个同量纲的抗氧化活性指标。综合DPPH法与FRAP法的结果表明，牛大力根部油脂具有较好的抗氧化活性，其中F-2部位的油脂抗氧化活性较F-1和F-3的活性强，这可能与F-2中富集含量较高的不饱和脂肪酸及其他抗氧化剂含量有关。

4 结论

牛大力为著名的药食两用植物，在广东、广西以及海南等地有大规模的种植栽培，具有重要的研究与开发价值。以上研究结果表明牛大力根油脂具有较好的抗氧化活性，其中可能存在大量的天然抗氧化活性物质，可开发成安全有效的抗氧化活性剂，在功能性食品、药品、保健产品、日化产品等行业具有广阔的研究与应用前景。

[1] 广东中药志编辑委员会.广东中药志：第一册[M].广州：广东科学技术出版社，1991：168.

[2] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草：第四卷[M].上海：上海科学技术出版社，1999：3296.

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AntioxidantActivityofLipidsfromMillettiaspeciosaRoot

GONGBao1，CHENDeli1，LIUYangyang1，FANGCao2，WANGDeli1，YANGXinquan1*

(1.HainanBranchInstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Wanning571533，China；2.HainanProvincialNongKenHospital，Haikou，570311，China)

Objective：The aim of this study was to investigate the antioxidant activities of lipids from theMillettiaspeciosaroot.Methods：The lipophilic extracts F-1 and F-2 were isolated from the dry root ofM.speciosaby 70% ethanol extraction method and silica column chromatography.Meanwhile，lipophilic extract F-3 was extracted by heat reflux.Whereafter the antioxidant activity of F-1，F-2 and F-3 extracts were investigated by means of DPPH and FRAP assay.Results：The results showed that the half inhibitory concentration (IC50) of extracts of F-1，F-2 and F-3 were 203.18，138.38 and 244.10 μg·mL-1，respectively，with DPPH method，and their FRAP values were (7 712.2±274.7)，(10 387.5±280.5) and (4 584.1±182.3) μmol Fe2+·g-1，respectively，as well.The IC50of ascorbic acid (Vc) and BHT were respectively 11.59 and 53.69 μg·mL-1，and their FRAP values were (17 356.1±622.9)，(13 235.4±469.5) μmol Fe2+·g-1.Conclusion：The oil fractions are moderate to good in scavenging effect on DPPH radical and reducing power.

Millettiaspeciosa；lipids；antioxidant activity

2015-01-07)

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2013HNB02)；海南省自然科学基金(20152019)

*

杨新全，副研究员，研究方向：南药研究与开发；E-mail：yangxinquan@sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.009