寇学良，杨东花，苏英英，刘峰

(1.商洛市中心医院，陕西 商洛 726000；2.陕西步长制药有限公司，陕西 咸阳 712000)

·基础研究·

丹参中丹酚酸A和丹酚酸B的ESI-MS/MS裂解规律解析

寇学良1*，杨东花2，苏英英2，刘峰2

(1.商洛市中心医院，陕西 商洛 726000；2.陕西步长制药有限公司，陕西 咸阳 712000)

目的：使用线性离子阱傅立叶转换串联质谱仪，对丹参中丹酚酸A和B进行多级裂解分析，探析其裂解规律。方法：采用进样针直接进样的方法，使用碰撞诱导解离(CID)裂解模式，对丹酚酸A和B进行多级裂解分析，Xcalibar V2.0进行数据分析，对碎片离子分子式推导，偏差设置为20。对两个化合物的裂解进行初步分析，全扫描及多级碎裂扫描的分辨率为30 000，多级碎裂模式为CID，碎裂能为35%。结果：丹酚酸类化合物在多级碎裂中，主要表现为丹参素基的丢失，且CO和H2O的丢失也较为明显。结论：本研究使用LTQ-Orbitrap高分辨质谱对两个化合物裂解途径进行分析，探讨其可能的裂解规律，为快速对中药材中该化合物的鉴别及其代谢物的鉴别提供实验数据支撑和思路。

丹参；高分辨；裂解

丹参为唇形科植物SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根茎，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈的功能，常用于治疗胸痹心痛，脘腹胁痛，癥瘕积聚，热痹疼痛，心烦不眠，月经不调，痛经闭经，疮疡肿痛[1]。近年来，随着LC-MS检测技术的发展，HPLC-MS/MS在单味药和中药大复方中的应用越来越广泛。实验研究发现，丹参中的丹酚酸A和B具有防治心血管疾病的作用[2-3]；丹酚酸A对缺血再灌注心肌具有一定的保护作用[4]，丹酚酸B对心脏缺血再灌注、脑缺血再灌注具有一定的保护作用[5-6]。近年来，LC/MS/MS实现了从中药中体外成分鉴定到体内吸收成分及其代谢物的鉴定[7-9]。因此，有必要对中药材中活性成分进行裂解规律研究。本实验选取两种来自于丹参中的化学成分，使用线性离子阱傅立叶转换串联质谱仪(LTQ-Orbitrap)对其多级质谱裂解规律做初步的分析，为快速精准地在复杂体系中鉴别该两种成分及其代谢物，提供数据支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器

超高压液相色谱-电喷雾-线性离子阱傅立叶转换串联质谱仪(UHPLC-ESI-LTQ-Orbitrap)，Thermo Scientific ，配有电喷雾离子源(ESI)；Xcalibar 2.0工作站，分析天平。

1.2 试药

丹酚酸A(批号：MUST-13020701，成都曼思特生物科技有限公司，CAS：96574-01-5)；丹酚酸B(批号：111562-201110，中国食品药品检定研究院，CAS：115939-25-8)；甲醇为色谱纯；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 质谱条件

离子化模式：ESI源；正负离子模式；正离子，Sheath Gas Flow rate (arb)：35，Aux Gas Flow Rate (arb)：0，Sweep Gas Flow Rate(arb)：0，I Spray Voltage (KV)：5，Capilary Temp(℃)：350，S-Lens RF Level(%)：67.7；负离子，Sheath Gas Flow rate (arb)：35，Aux Gas FlowRate(arb)：0，Sweep Gas Flow Rate(arb)：0，I Spray Voltage(KV)：4.8，Capilary Temp(℃)：350，S-Lens RF Level(%)：60.0。

2.2 标准液的配制

分别精确称取2 mg丹酚酸A、丹酚酸B于25 mL量瓶中，用甲醇溶解，制成标准溶液，密封，保存于4 ℃冰箱，备用。

2.3 方法

实验前，分别使用对应的校正液对正负离子模式进行校正。使用进样针分别吸取200 μL左右的标准溶液，首先在正离子模式下进样分析，正离子模式下分析完成后，切换至负离子模式，1.5 h后相同条件进行负离子模式下的进样分析。

2.4 结果

丹酚酸A和B属于酚酸类化合物，从实验结果可以得出，酚酸类化合物在负离子模式下有较好的响应，因此，应选择负离子模式对其进行分析。丹酚酸A的扫描范围为m/z50～600、丹酚酸B的扫描范围为m/z50～800。全扫描及多级质谱(MSn)扫描分辨率为30 000；MSn碎裂方式为文献使用的碰撞诱导解离(CID)，能量为35%。

2.4.1 丹酚酸A裂解规律探析 丹酚酸A在正离子模式下无响应，在负离子模式下的多级质谱图见图1。在负离子模式下，失去一个H，得到分子离子峰m/z493.114 96，然后将493在CID模式下进行碎裂，得到碎片离子m/z359.080 23，313.073 41，295.061 34。m/z359，313，295经高分辨率数据推导，分子式分别为C18H15O8(11.797)，C17H13O6(3.563)，C17H11O5(2.339)，分别由分子离子丢失C8H6O2(-11.198)，C9H8O4(10.218)，一分子丹参素得到。然后选择m/z313进行三级碎裂，得到碎片离子m/z203.036 24和295.062 99，将m/z203，295进行分子式推导，分别为C11H7O4(6.023)和C17H11O5(5.355)，分别丢失的为C6H6O2(-9.642)和H2O。然后将m/z295进行三级碎裂，得到了碎片离子，m/z159.045 15，109.029 45，将m/z159，109进行分子式推导，分别为C10H7O2(6.501)和C6H5O2(9.943)，分别丢失的为C7H4O3(5.106)和C11H6O3(3.518)。丹酚酸A在负离子模式下的裂解图见图2。

注：A.MS2 493@CID35；B.MS3 493@CID35，313@CID35；C.MS3 493@CID35，295@CID35。图1 丹酚酸A在负离子模式下的MSn图

图2 丹酚酸A在负离子模式下可能的裂解方式图

2.4.2 丹酚酸B裂解规律探析 丹酚酸B属于酚酸类物质，在负离子模式下的多级质谱图见图3。在负离子模式下有较好的响应，在负离子模式下，失去一个H，得到分子离子峰，m/z717.841 07，将m/z717在CID模式进行碎裂，得到碎片离子m/z519.092 42和321.040 62，将m/z519和321进行分子式推导，得到C27H19O11(1.827)和C18H9O6(1.256)，分别由分子离子峰丢失一分子C9H10O5(0.645)和二分子C9H10O5(1.442)得到。将m/z519进行三级碎裂，得到碎片离子m/z339.050 75和321.040 62，推导分子式为C18H11O7(0.821)和C18H9O6(1.076)，分别由m/z519丢失C9H8O4(0.821)和C9H10O5(0.821)得到；将m/z339进行四级碎裂，得到碎片离子m/z295.060 82和277.050 69，推导m/z295和227分子式分别为C17H11O5(0.970)和C17H9O4(0.885)，分别丢失CO2，CO2和H2O得到。将m/z321进行三级碎裂，得到碎片离子m/z293.044 93和279.029 45，推导m/z293和279分子式分别为C17H9O5(2.969)和C16H7O5(2.330)，分别丢失CO和C2H2O得到。其负离子模式下的裂解图见图4。

注：A.MS2 717@CID30；B.MS3 717@CID30，519@CID30；C.MS4 717@CID30，519@CID30，339@CID30；D.MS3 717@CID30，321@CID30。图3 丹酚酸B在负离子模式下的MSn图

图4 丹酚酸B在负离子模式下可能的裂解方式图

3 结论

通过使用高分辨质谱对丹酚酸A和B可能的裂解规律进行分析，发现丹酚酸A和B等酚酸类化合物在负离子模式下有较好的响应。丹酚酸A和B都是以丹参素为母核的化合物，因此，在质谱裂解中，都会脱去一分子或二分子丹参素，再连续脱去CO、H2O。例如，在丹酚酸A中，分子离子m/z493脱去一分子丹参素(C9H10O5，m/z198)，得到m/z295。在丹酚酸B中，分子离子m/z717脱去一分子丹参素(C9H10O5，m/z198)得到m/z519，脱去二分子丹参素(C9H10O5，m/z198)得到m/z321。本研究对丹参中两个化合物进行多级碎裂分析，为其在中药及其大复方、代谢物的分析中提供了有价值的质谱数据。随着科学技术的发展，LC-MS/MS技术在中药成分鉴定方面将得到广泛的应用，利用MSn技术对中药中的成分进行裂解规律方面的分析总结，在一定程度上能够提高对中药成分及其代谢物检测分析的准确性。

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ESI-MS/MSAnalysisofSalvianolicAcidAandSalvianolicAcidBfromSalviamiltiorrhiza

KOUXueliang1*，YANGDonghua2，SUYingying2，LIUFeng2

(1.ShangluoCentralHospital，Shangluo726000，China；2.ShaanxiBuchangPharmaceuticalCo.Ltd.，Xianyang712000，China)

Objective：In this study，LTQ-Orbitrap high-resolution MS was used to explore the main fragmentation of salvianolic acids A and B using the CID type，which were isolated from the roots and rhizomes ofSalviamiltiorrhiza.Methods：The standard solution were injected into the MS to gain the MSndata of the two constituents，respectively，the resolution of the full scan and MSnscan was 300 00，the fragmentation type was CID，and the energy was 35%.Results：The salvianolic acids A and B were a kind of phenolic acid constituents，it had a good response under the negtive model ESI-MS.The fragmentation of salvianolic acids were mainly for the loss of danshensu group，and CO and H2O were also obvious.Conclusion：The LTQ-Orbitrap was used to reveal the fragmentation pathway of salvianolic acids A and B from which the MSnfragment ions were obtained，and it will provide a high-efficiency and sensitive method to identity the two constituents from the roots and rhizomes ofS.miltiorrhizaand its related metabolites.

Salviamiltiorrhiza；high-resolution；fragmentation.

2015-02-05)

*

寇学良，副主任药师，研究方向：中药新药研发；E-mail：XL111900@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.007