王荣琼　刘永张　邹丰才　杨建发　彭洁.云南农业职业技术学院，昆明650；.云南省昆明动物园，昆明6500；.云南农业大学动物科学技术学院，昆明6500

孔雀嗉囊毛细线虫的分子鉴定

王荣琼1刘永张2邹丰才3*杨建发3彭洁1
1.云南农业职业技术学院，昆明650212；2.云南省昆明动物园，昆明650021；3.云南农业大学动物科学技术学院，昆明650201

通过分子生物学方法对来自昆明市圆通山动物园孔雀消化道中收集的线虫进行鉴定。结果显示，该线虫与GenBank发表的澳大利亚袋鼠毛细线虫COX1序列的相似性为77.3%，证明该线虫为毛细科毛细属的毛细线虫。COX1序列分析表明序列差异较明显，说明孔雀毛细线虫不同于澳大利亚袋鼠毛细线虫，它们存在着遗传背景的差异。

孔雀；毛细线虫；COX1序列；分子鉴定

毛细线虫病是由毛细科（Capillariidae）毛细属（Capillaria）的多种线虫寄生于禽类食道、嗉囊、肠道等消化道内的一种寄生虫病。轻度感染时，局部出现轻微炎症和增厚；严重感染时，炎症加剧，并出现黏液或浓性分泌物，剖检可见寄生部位消化道出血，黏膜上有大量虫体，严重感染时，可引起死亡。病初如误用消炎药或抗球虫药，会延误病情的治疗，因此对其鉴定到种显得由为重要[1]。

本项试验拟进一步深入研究形态学所不能解决的问题，欲通过分子生物学技术鉴定孔雀嗉囊内的毛细属线虫，以期能确定到种。这是首次在云南采用分子生物学的方法对孔雀寄生虫的种属关系进行鉴定。对保护世界濒危物种及鉴定寄生虫的种类来丰富虫种资源有重要的意义。也为今后孔雀体内线虫的分类、鉴别诊断、分子流行病学调查以及本病的防治等更深入的研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

虫体样品：由昆明市圆通山动物园提供。

主要试剂：购买于北京百泰克生物技术有限公司。

1.2方法

1）虫体的分离及处理。将园内发病死亡的1只成年孔雀，用寄生虫学完全解剖法获取寄生于孔雀嗉囊内的线虫，将洗净的虫体转移到新的离心管中用75%乙醇保存备用。

用镊子将保存在75%乙醇溶液中的虫体材料取出，用双蒸水反复吹打冲洗2～3次后，置于一新的1.5 mL的离心管中。

2）虫体DNA的提取。虫体DNA提取按细胞/组织基因组DNA提取试剂盒使用说明进行。

3）虫体DNA的PCR扩增。扩增体系中各试剂的量分别是ddH2O 10.75μL，10×PCR buffer 3.0 μL，MgCl2（25 mmol/L）4.0μL，dNTPs（2.5 mmol/L each）3.0μL，Forward primer（50 pmol/μL）0.5μL，Reverse primer（50 pmol/μL）0.5μL，rTap（5 U/μL）0.25μL，模板（gDNA）3.0μL，共计25μL。混匀然后于PCR扩增仪中按已设好PCR扩增条件进行扩增。

PCR扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环，最后72℃延伸5 min。

扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，于紫外透射仪上观察结果，并拍照记录。

4）引物的设计。依据Bowles文献[10]设计1对引物，扩增了从孔雀嗉囊内分离的线虫线粒体DNA（mtDNA）细胞色素C氧化酶第1亚基（COX1），由上海生物工程技术有限公司产品合成。

JB3（5′-TTTTTTGGGGATCCTGAGGTTTAT-3′）

JB4.5（5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′）

2　结果与分析

2.1测序结果

电泳后，通过线性DNA条带的相对位置可初步估计样品的分子量大约为450 bp左右，如图1所示。

图1　扩增的线虫c o x 1 RCR产物

序列碱基数共计417个bp：

CCAATCATGATCTCGCATTTGGTGCAGTTTCT GAGCTTTGATAAATATTTCAGGAAAGTTTAAAGTA TTTGGCCCATTAGGAATAATCTATGCTATAATAAG AATCGGCTTATTAGGCTGTTTTGTTTGAGGTCATCA TATATATACTGTAGGAATAGACGTGGACACACGA GCATATTTTACTGCTGCTACTATGATCATTGGAGTC CCTACTGGAGTAAAAGTATTTAGCTGAATGGCTAC TATATACGGAACTTCCACTAAATCTTCACCTCTTTT ACTATGAACTTTAGGATTTATTTCATTATTTACAAT TGGAGGTCTAACCGGAATTTCTCTCTCTAATGCTT CTTTAGATCTTCTACTTCATGATACATACTACGTAG TAGGTCATTTTCATTATGTTCTTTCTTTAAA

测序结果与预期的一致，将上述测序结果上传到网上进行Blast分析，结果显示该线虫与澳大利亚袋鼠体内的毛细线虫有77.3%的同源性，因此确认该线虫为毛细线虫。

2.2 COX1序列的分析与比较

测序后去掉引物，找到COX1序列的头尾，结果发现孔雀毛细线虫样品的COX1序列的长度为417 bp，而澳大利亚袋鼠毛细线虫COX1序列（GenBank注册号AJ288162.1）的长度为374 bp。

图2　样品与网上澳大利亚袋鼠的毛细线虫COX1的相似百分比

图3　COX 1对比的进化树

将该线虫的COX1序列与网上公布的澳大利亚袋鼠毛细线虫COX1序列用DNA Star软件进行比较相似百分比分析（图2～3）可知，其COX1相似性为77.3%，序列差异较明显（图4）。发现孔雀毛细线虫单独形成一个分支，说明孔雀毛细线虫不同于袋鼠毛细线虫，他们存在着地域及遗传背景的差异。也说明了孔雀毛细线虫COX1序列存在种的特异性，可作为鉴别孔雀毛细线虫与相似种的有效遗传标记。

图4　孔雀毛细线虫与澳大利亚袋鼠毛细线虫CO X 1序列比较

3　结论

野生动物寄生虫研究较少，很多寄生虫严重威胁着我国珍贵野生动物。将该线虫的COX1序列与GenBank公布的澳大利亚袋鼠的毛细线虫的COX1比较分析，相似性为77.3%。说明孔雀毛细线虫与袋鼠毛细线虫具有遗传背景差异，也说明孔雀毛细线虫COX1序列存在种的特异性，可作为鉴别孔雀毛细线虫与相似种的有效遗传标记。但对野生动物寄生虫的研究远远还不够，需要投入更多的人力和物力来填补这方面的空白[2-6，8]。

近年来线粒体DNA已被广泛用作多态性研究的重要遗传标记，结合PCR扩增及其他方法已成功地应用于多种寄生虫的分子鉴定和分类，通过其序列的变化可反映生物种群内和群体间的遗传变异，且mtDNA特别适用于相似种和亚种的鉴定[7-8]。

[1]谢辉，冯志新.香港地区螺旋线虫种类记述[J].华中农业大学学报，1996，15（1）：30-34.

[2]王伯瑶，黄宁主编.分子生物学技术[M].北京：北京大学医学出版社，2006：37-45.

[3]王洪英.蓝孔雀常见疾病的症状及防治措施[J].养殖技术顾问，2009（4）：55-56.

[4]陈虹虹，陈晓梅，朱兴全，等.PCR-SSCP对我国鲁道夫对盲囊线虫的分子鉴定[J].中国兽医学报，2006，26（1）：35-38.

[5]索勋，杨晓野.高级寄生虫学实验指导[M].北京：中国农业科学技术出版社，2005：221-228.

[6]牛庆丽，罗建勋，殷宏.转录间隔区（ITS）在寄生虫分子生物学分类中的应用及其进展[J].中国兽医寄生虫病，2008，16（4）：41-44.

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2015-07-04

云南省教育厅科学研究基金项目（2010C130）

王荣琼，女，1978年生，在职兽医硕士，副教授。