仝其广 毛雯 张苗苗 张琦 岳志刚 许慧 刘娅 周艳秋 范煜东刘鹏 吴迪 胡大一

临床研究

吸烟者外周血白细胞胆固醇逆转运基因表达的变化

仝其广 毛雯 张苗苗 张琦 岳志刚 许慧 刘娅 周艳秋 范煜东刘鹏 吴迪 胡大一

目的 研究吸烟者外周血白细胞胆固醇逆转运相关基因表达的状况，以及不同吸烟水平者基因表达的差异。方法 采用实时荧光定量PCR方法，测定吸烟者和非吸烟者外周血白细胞ABCA1、ABCG1和ApoAI mRNA表达水平。结果 吸烟者ABCA1 mRNA表达水平较对照组显著降低（0.38±0.11比1.42±0.55，P＜0.05），中重度吸烟者降低较明显（0.21±0.08 比 1.42±0.55，P＜0.05）。ABCG1 和 ApoAI mRNA 表达水平无显著降低（4.96±1.65 比 4.28±2.59，P=0.817；0.21±0.09 比 0.69±0.29，P=0.086）。ABCA1 mRNA 表达与吸烟、吸烟量均呈负相关（r=-0.349，P=0.037；r=-0.341，P=0.042）。多元线性回归分析未见吸烟与ABCA1表达呈独立相关性（β=-0.516，P=0.591）。结论 吸烟干扰外周血白细胞ABCA1基因表达，并存在剂量效应关系。这可能是吸烟引起动脉粥样硬化的一个机制。

吸烟； 胆固醇逆转运； 基因表达

胆固醇逆转运功能是高密度脂蛋白（HDL）抗动脉粥样硬化的重要机制，而ABCA1和ABCG1构成了细胞内胆固醇流出的关键控制因子，ApoA1则是经ABCA1旁路胆固醇流出的细胞外主要接受体。吸烟是心血管病的主要危险因素之一。25%～30%的缺血性心脏病死亡可以归因于吸烟。大量研究显示，吸烟可诱发氧化应激、血管炎症、血小板凝集、血管功能失调和血脂异常（HDL-C降低、总胆固醇和甘油三酯升高）等[1]。吸烟是否影响外周血白细胞ABCA1和ABCG1的表达，这对从分子水平和保护性机制变化方面认识吸烟的致AS作用很有意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择在煤炭总医院门诊或住院的个体，其中吸烟者21例，男性14例，女性7例，平均年龄（62.14±11.60）岁；不吸烟者 15例，男性 9例，女性6例，平均年龄（66.07±11.70）岁。收集研究对象的基本资料、家族史、既往史、吸烟和饮酒史等。凡有下列情况者予以排除：糖尿病、急性心肌梗死或脑卒中、入院前或体检前1个月内服用他汀或其他降脂药物、心力衰竭、严重肝肾功能损害、血液病、甲状腺疾病、肿瘤、绝经后妇女用激素替代治疗。

1.2 研究方法

1.2.1 吸烟分级 按照吸烟量分为不吸烟、轻度吸烟（吸烟支数＜200支/年）和中重度吸烟（吸烟支数≥200支/年）。

1.2.2 血清学指标测定 清晨空腹（12 h）取静脉血。按标准方法测定血脂、血糖、血清肌酐、尿素氮和高敏C反应蛋白（hs-CRP）等生化指标。

1.2.3 外周血白细胞ApoA1 mRNA表达

1.2.3.1 RNA提取 清晨空腹取静脉血（12 h）2 ml置入EDTA抗凝管内，并加入RNA保存液中，-80℃冰箱保存，1周内完成RNA提取。按照文献方法提取外周血白细胞RNA[2]。所有标本RNA均进行纯度、浓度和完整性检验。

1.2.3.2 基因表达 白细胞总RNA逆转录成cDNA。逆转录体系（20 μl体系）：RNA 3 μl，5×Buffer 4 μl，dNTP 1 μl，Oligo（dT）1 μl，逆转录酶 0.5 μl，DEPC H2O 10.5μl。逆转录程序：42℃保温60 min。95℃5 min，4℃ 5 min，迅速放入-20℃长期冻存。荧光定量反应（PCR）体系为25μl含：基因组 cDNA 2 μl，上游和下游引物分别为5 pmol，dNTPmix 5 nmol，Taq酶1 U，Taq酶缓冲液2.5μl及灭菌去离子水适量，应用自动循环仪进行扩增。扩增条件为：预变性94℃ 5 min。反应循环为：变性94℃ 30 s、退火61℃ 30 s、延伸72℃ 30 s，循环35次；最后72℃延伸 10 min。基因mRNA表达以β-actin标化。

引物：β-actin 上游引物 5′-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3′，下游引物 5′-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3′；ApoAI基因，上游引物 5′-CCGCCGTTCTCCTTGAGAG-3′，下游引物 5′-AGAAGAAGTGGCAGGAGGAGATG-3′ABCA1 基因，上游引物 5′-GGCTGTGTCTCGTATTGTCTG-3′，下游引物 5′-CCTTGTGGCTGGAGTGTCA-3′；ABCG1上游引物 5′-AGAAAGACTTTGAAAGAGTT-3′，下游引物 5′-GGTAAATCACATACTTTGTT-3′。RNA提取和引物合成及荧光定量PCR均由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司负责完成。

1.3 统计学方法 所有数据用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，偏态分布转化为正态分布后再进行分析。两组间比较采用t检验或Mann-whitney U检验，多组间比较采用ANOVA分析。计数资料应用χ2检验，参数间单因素相关分析采用Pearson分析，线性回归用于参数独立相关分析。双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 吸烟组与不吸烟组一般临床资料比较 两组基础资料比较显示，吸烟组饮酒比例明显高于不吸烟组（P＜0.05）。两组之间其他基线资料如性别比例、体重指数、高血压与冠心病比例比较未见统计学差异。见表1。

表1 两组一般临床资料比较（±s）

表1 两组一般临床资料比较（±s）

注：与吸烟组比较，aP＜0.05

组别 例数 年龄（岁） 男/女 体重指数（kg/m2） 高血压（%） 冠心病（%） 饮酒（%）吸烟组 21 62.14±11.60 14/7 26.01±5.38 42.9 73.3 38.1不吸烟组 15 66.07±11.70 9/6 26.70±5.18 46.7 71.4 0.0a

2.2 两组临床生化指标比较 吸烟组和不吸烟组之间血脂指标比较未见统计学差异（两组间ApoA1比较接近统计学差异，P=0.065）。两组肝肾功能指标和血糖水平比较也未见统计学差异。见表2。

2.3 吸烟程度对血脂的影响 随吸烟量的增加，HDL-C和ApoA1水平呈现逐渐降低趋势，中重度吸烟组与不吸烟或轻度吸烟组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 3。

表2 两组生化指标比较（±s）

表2 两组生化指标比较（±s）

注：TC：总胆固醇；TG：甘油三酯；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；ApoA1：载脂蛋白A1；ApoB：载脂蛋白B；ALT：丙氨酸转氨酶；BS：空腹血糖；BUN：尿素氮；Cr：肌酐

Cr（μmol/L）吸烟组 21 4.14±1.63 1.44±0.86 1.24±0.30 2.15±0.90 1.23±0.26 0.91±0.39 18.64±9.72 5.63±0.55 5.02±2.40 64.64±28.22不吸烟组组别 例数 TC（mmol/L）TG（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）ApoA1（g/L）ApoB（g/L）ALT（U/L）BS（mmol/L）BUN（mmol/L）15 3.50±1.02 1.80±2.04 1.11±0.27 1.91±0.73 1.08±1.19 0.75±0.35 20.10±10.62 5.81±1.36 5.37±1.22 73.00±13.35

表3 不同吸烟程度个体HDL-C和ApoA1水平比较（±s）

表3 不同吸烟程度个体HDL-C和ApoA1水平比较（±s）

注：HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；ApoA1：载脂蛋白A1。与中重度吸烟组比较，aP＜0.05

组别 例数 HDL-C（mmol/L） ApoA1（g/L）不吸烟组 15 1.24±0.30a 1.23±0.26a轻度吸烟组 9 1.22±0.12a 1.14±0.15中重度吸烟组 12 0.99±0.29 1.04±0.22

2.4 吸烟对外周血白细胞胆固醇逆转运基因mRNA表达的影响 吸烟组ABCA1基因mRNA表达水平较对照组明显降低（P＜0.05），ABCG1基因表达未见统计学差异，见图1、2。

图1 吸烟对外周血白细胞ABCA1 mRNA的影响

图2 吸烟对外周血白细胞ABCG1 mRNA的影响

进一步按不同吸烟量分析，结果显示，随着不吸烟、轻度吸烟和中重度吸烟吸烟量的增加，ABCA1基因mRNA表达水平呈逐渐降低的趋势，其中不吸烟组和中重度吸烟组之间差异有统计学意义（P＜0.05），见图 3。

图3 吸烟程度对外周血白细胞ABCA1 mRNA的影响

对于ApoA1基因表达而言，吸烟组和对照组之间未见统计学差异（P＞0.05），见图4。

2.5 吸烟者胆固醇逆转运基因mRNA表达相关性分析 单因素相关分析显示，吸烟与ABCA1 mRNA表达呈负相关（r=-0.349，P=0.037），与 ABCG1 表达不相关（r=0.04，P=0.817）；吸烟量与 ABCA1 表达呈负相关（r=-0.341，P=0.042），与 ABCG1 表达不相关（r=0.00，P=0.998）。饮酒与吸烟呈正相关（r=0.452，P=0.006），与 ABCA1 表达无相关性（r=-0.135，P=0.431）。多元线性回归分析未见吸烟与 ABCA1表达有相关性（β=-0.516，P=0.591）。

3 讨论

胆固醇逆转运（RCT）是HDL抗动脉粥样硬化发挥心血管保护作用的重要机制。ABCA1、ABCG1是控制细胞胆固醇流出——RCT第一步的关键基因。这些基因功能正常与否对于细胞内胆固醇积聚、动脉粥样硬化的发生发展起到关键调节作用。

图4 吸烟对外周血白细胞apoA1 mRNA的影响

吸烟是动脉粥样硬化的主要危险因素之一[3]。已发现，与不吸烟者比较，吸烟者的血清HDL-C水平较低，而停止吸烟后其HDL-C水平可迅速回升[2,4]。本研究也观察到吸烟者HDL-C浓度呈现减少趋势，但未见统计学差异。这可能与样本例数偏少有关。另外，吸烟者饮酒比例较高，饮酒具有一定程度升高HDL作用，也有可能影响HDL或ApoA1的水平。这些都提示吸烟对于具有血管保护作用的脂蛋白产生负性影响。

研究进一步观察到，随着吸烟量增加，HDL-C和ApoA1呈现降低趋势。最近一项包括近60 000人的大规模队列研究同样显示，吸烟者HDL-C和ApoA1水平较低，并且吸烟与二者之间呈量效关系，即每日吸烟量越大，HDL-C和ApoA1越低[5]。这种吸烟与血脂指标间的剂量-效应关系也为其他研究所证实[6-8]。HDL和ApoA1将外周组织如动脉壁内胆固醇转运至肝脏代谢排出，是抗动脉粥样硬化的脂蛋白，具有心血管保护作用。这从一个方面也说明长期大量吸烟对于心血管的致病性。

吸烟对血脂谱呈现负性作用，损伤胆固醇逆转运过程的细胞外受体（HDL-C和ApoA1）是否也影响细胞胆固醇流出相关基因表达，从而干扰细胞内胆固醇平衡。本研究进一步显示，外周血白细胞ABCA1 mRNA和ApoA1 mRNA表达减少，并且随着吸烟量的增加，两个基因表达都呈进一步降低趋势。这表明吸烟损害胆固醇逆转运基因转录表达环节，并且随着吸烟量的增加损伤也增加。Li等[9]的研究显示，男性吸烟者ABCA1 mRNA和ABCG1 mRNA表达较非吸烟男性低。因此，吸烟对控制胆固醇流出基因具有抑制作用。

ABCA1介导胆固醇从巨噬细胞流出至乏脂的ApoA1，而ABCG1介导胆固醇从巨噬细胞流出至成熟的HDL，从而通过ApoA1和HDL将胆固醇从巨噬细胞内转出，转运至肝脏代谢清除。由此可见，吸烟在基因水平改变胆固醇流出相关基因的表达，有可能促进巨噬细胞水平的胆固醇蓄积，从而促进动脉粥样硬化的产生与进展。因此，吸烟有可能通过抑制细胞胆固醇流出基因的表达而引起或加重动脉粥样硬化。

本研究采用人循环单核白细胞进行基因表达检测，该类细胞在包括血管壁的外周组织内将分化成为巨噬细胞。肝细胞和巨噬细胞是研究RCT的合适标本，但难以应用于人体研究中。据报道，外周血白细胞RCT的调节机制与肝脏相似，可以代表肝细胞相关基因[10]。

我们观察到，两个RCT相关基因表达与血清HDL-C和apoA1水平无关，这说明外周血白细胞ABCA1 mRNA和apoA1 mRNA基因表达对于血清抗动脉粥样硬化脂蛋白的产生没有影响。吸烟导致HDL等脂蛋白水平降低不是通过作用于RCT基因所致。文献也显示，单核巨噬细胞ABCA1基因表达对于血浆HDL-C浓度没有作用，而肝细胞ABCA1等基因表达对血清HDL-C水平产生重要影响[11,12]。

吸烟降低HDL-C的机制仍未完全清楚。吸烟能够促进儿茶酚胺释放，由此导致游离脂肪酸增加，从而使VLDL和LDL浓度升高，有利于脂质积聚于血管内，引起HDL-C降低[13,14]。吸烟也可增加胆固醇酯转移蛋白，降低卵磷脂胆固醇乙酰转移酶活性，影响ApoA1合成或增加TG[15,16]。吸烟影响细胞胆固醇流出基因的机制尚不清楚。体外实验提示，烟草成分可对人外周血单核细胞免疫或应激相关基因的表达产生影响[17]。人体内研究表明，吸烟与外周血单核细胞DNA甲基化有关[18,19]。吸烟如何作用于外周血白细胞ABCA1和ApoA1 mRNA的表达仍需要进一步的探讨。

长期大量吸烟可引起血清抗动脉粥样硬化脂蛋白水平减少及外周血白细胞RCT相关基因表达降低，且吸烟量越大，这种效应越明显。戒烟后，HDL-C水平可回升。这些都提示吸烟可在血清学水平和分子水平影响动脉粥样硬化发生。人们应远离烟草，以预防动脉粥样硬化性心血管病的发生。

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Cholesterol reverse transport gene expression in peripheral blood leukocytes from subjects of smokers

TONG Qi-guang＊，MAO Wen，ZHANG Miao-miao，et al.＊Heart Center，China Meitan General Hospital，Beijing 100028，China

ObjectiveTo investigate cholesterol reverse transport gene expression in peripheral blood leukocytes from smokers and non smokers，and to further analyse the relationship accord to the degree of smoking.MethodsThirty-eight cases were enrolled，peripheral blood leukocytes ABCA1，ABCG1 and ApoAI mRNA expression were measured by real-time quantitative PCR.ResultsABCA1mRNA expression in smokers was obviously less than that in controls（0.38±0.11 vs 1.42±0.55，P＜0.05）.Of which，it was lower for moderate or severe smokers（0.21±0.08 vs 1.42±0.55，P＜0.05）.There were not statistically difference for ABCG1 and ApoAI mRNA expression（4.96±1.65 vs 4.28±2.59，P=0.817，0.21±0.09 vs 0.69±0.29，P=0.086）.Smoking and its amounts were negatively with ABCA1 mRNA expression （r=-0.349，P=0.037，r=-0.341，P=0.042）.Using multivariant linear regression analysis method，it was shown that ABCA1 mRNA expression was not dependly associated with the smoking（β=-0.516，P=0.591）.ConclusionABCA1 mRNA expression in the peripheral blood leukocytes from smokers was inhibited，and it was dose-effect response.It may indicate a mechansim that smoking results in atherosclerosis by this way.

Smoker； Cholesterol reverse transport； Gene expression

首都医学发展科研基金（项目编号：2007-3127）

100028 北京市，煤炭总医院心脏中心（仝其广、毛雯、张苗苗、张琦、范煜东、刘鹏、吴迪），检验科（岳志刚、许慧、周艳秋），病案室（刘娅）；北京大学人民医院心脏中心（胡大一）

10．3969/j．issn．1672－5301．2015．08．011

R54

A

1672-5301（2015）08-0715－05

2015-05-15）