袁明辉，郑鸿声，王东武，谢爱芳

(1.山东省威海市药品检验所，山东 威海 264200;2.山东省威海市经区医院心理科，山东 威海 264205;3.迪沙药业集团，山东 威海 264200)

R－3－奎宁环醇化学名为1－氮杂环[2.2.2]辛 R－3－醇，是合成毒蕈碱受体拮抗药，如索利那新、瑞伐托酯、他沙利定、阿地溴铵等的重要中间体[1－6]。其合成是以3－奎宁环酮为原料，经羰基还原生成(R，S)－3－奎宁环醇后，再经拆分而得[7－9]。拆分后的 R－3－奎宁环醇光学纯度均通过测定旋光度再计算ee值进行描述[2，7－8，10]，然而旋光度法测定的光学纯度影响因素较多，如偏振光波长、溶液的浓度、温度及旋光性杂质，误差较大[11]。随着手性液相色谱技术的发展，高效液相色谱(HPLC)法已广泛应用于对映体光学纯度的测定[12－15]。有关 R－3－奎宁环醇的光学纯度检测的HPLC法至今尚未建立，主要原因一方面由于 R－3－奎宁环醇缺少发色基团，不适用于常规的液相色谱法检测;另一方面，由于其手性中心缺乏能与手性色谱柱填料产生氢键、偶极－偶极作用、π－π作用或空间作用的基团，难以进行手性色谱法分离。为此，笔者开发了柱前衍生手性色谱法测定 R－3－奎宁环醇光学纯度的方法。该方法利用柱前衍生化法，使(R，S)－3－奎宁环醇与苯甲酰氯反应生成(R，S)－3－奎宁环醇苯甲酰氯衍生物，即3－苯甲酸奎宁环酯，再利用手性液相色谱法进行光学纯度测定，结果准确、可靠，可用于 R－3－奎宁环醇光学纯度的准确测定。

1 仪器与试药

UltiMate 3000型高效液相色谱仪，包括四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、变色龙色谱工作站(美国戴安公司);1500型高效液相色谱仪，包括Module数据处理器、单元恒流泵、紫外检测器、CSChrom Plus色谱工作站(美国SSI series公司);Thermal Syncronis C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);AD －H 手性色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，日本大赛璐 Chiralpak公司);恒温水浴锅(江苏金坛科兴仪器厂);电子恒速搅拌器(上海申生科技有限公司)。正己烷(天津市彪仕奇科技有限公司，批号为000405)，乙醇(天津市彪仕奇科技有限公司，批号为121210)均为色谱纯;二乙胺(天津登科化学试剂有限公司，批号为20120925)，苯甲酰氯(江苏强盛功能化学股份有限公司，批号为 20120502)均为分析纯;R－3－奎宁环醇(纯度不低于99.0%，批号为 SLNX－04－63－16－20)，(R，S)－3－奎宁环醇(3－奎宁环醇消旋体，纯度不低于99.0%，批号为SLNX－01－63－12－30)均由迪沙药业集团药物研究院提供。

2 方法与结果

2.1 供试品衍生化法

2.1.1 3－奎宁环醇消旋体苯甲酰氯衍生化反应

衍生化过程:向已有20 mL二氯甲烷的反应瓶中加入1.0 g 3－奎宁环醇消旋体，水浴反应温度保持在20～30℃，向反应瓶中先后加入0.47 g氢化钠和2.22 g苯甲酰氯，直到薄层色谱(TLC)跟踪原料反应完全。反应工艺流程见图1。

图1 (R，S)－3－奎宁环醇苯甲酰氯衍生化工艺流程图

后处理过程:冰水浴条件下，向体系中滴加1 mol/L的盐酸溶液，直至体系不放气为止，取二氯甲烷相，水相用20 mL二氯甲烷萃取1次，合并有机相。有机相用10 mL饱和食盐水洗涤1次，减压浓缩干后得3－奎宁环醇的衍生化产物，即为(R，S)－3－苯甲酸奎宁环酯。

2.1.2 R－3－奎宁环醇苯甲酰氯衍生化反应

取 R－3－奎宁环醇 1.0 g，按(R，S)－3－苯甲酸奎宁环酯的衍生化过程和后处理过程，制得 R－3－苯甲酸奎宁环酯。

2.2 对照品溶液制备

分别称取(R，S)－3－苯甲酸奎宁环酯、R－3－苯甲酸奎宁环酯各适量，加乙醇溶解后配制成质量浓度约为0.2 g/L的溶液，作为(R，S)－3－苯甲酸奎宁环酯对照品溶液、R－3－苯甲酸奎宁环酯对照品溶液。

2.3 样品的液相色谱分析

2.3.1 (R，S)－3－苯甲酸奎宁环酯的纯度测定

液相色谱系统采用美国戴安UltiMate 3000型液相色谱系统。色谱柱:Thermal Syncronis C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:缓冲盐(20 mmol/L乙酸铵，氨水调节 pH至7.50)－乙腈(70 ∶30);流速:1.0 mL/min;柱温:35 ℃;检测波长:232 nm;进样量:20 μL。按拟订方法对(R，S)－3－苯甲酸奎宁环酯的纯度进行测定，用面积归一化法计算纯度。由于(R，S)－3－奎宁环醇羟基空间位阻较大，衍生反应产率较低，起初未加入催化剂，衍生物产率仅为25%，后选氢化钠作催化剂，大大提高了反应的产率，3－奎宁环醇苯甲酰氯衍生产物收率达95%，产物纯度达98%，见图2 A。采用拟订方法对衍生产物(R，S)－3－苯甲酸奎宁环酯色谱峰进行峰纯度检测。结果峰纯度良好(匹配度为998，大于软件的推荐值990)，为单一色谱峰，见图2 B。

图2 (R，S)－3－苯甲酸奎宁环酯纯度测定色谱图及光谱图

2.3.2 R－3－苯甲酸奎宁环酯的光学纯度测定

色谱系统采用美国SSI series 1500型高效液色谱系统。色谱柱:日本大赛璐Chiralpak®AD－H手性色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:正己烷 － 乙醇 － 二乙胺(80 ∶20 ∶0.1)，配制后经0.45 μm 有机滤膜过滤，超声脱气;流速:1.0 mL/min;检测波长:232 nm;进样量:10 μL。首先对(R，S)－3－苯甲酸奎宁环酯、R －3－苯甲酸奎宁环酯分别进样分析，并进行系统适用性试验。结果显示，(R，S)－3－苯甲酸奎宁环酯达到良好分离(分离度 R≥4.0)，见图3 A;与 R－3－苯甲酸奎宁环酯色谱图(图3 B)对比，确定RT=7.42 min为 S构型，RT=11.60 min为 R构型。

图3 R－3－苯甲酸奎宁环酯纯度测定色谱图

2.3.3 R－3－奎宁环醇的光学纯度测定

取 R－3－奎宁环醇样品约1.0 g，按拟订方法进行衍生化反应，制备3－苯甲酸奎宁环酯。称取衍生化所得样品适量，配成质量浓度约为0.2 g/L的溶液，作为供试品溶液。按拟订方法对供试品溶液进行分析。结果 R－3奎宁环醇样品的光学纯度为96.66%，见图 4。

图4 R－3－苯甲酸奎宁环酯样品光学纯度色谱图

3 讨论

3.1 衍生化反应条件

衍生化试验初始条件:向已有20 mL二氯甲烷的反应瓶中加入3－奎宁环醇消旋体1.0 g，水浴保持反应温度为20～30℃，向反应瓶中加入苯甲酰氯2.2 g，观察薄层色谱跟踪原料反应情况。结果显示，反应缓慢，产率低。将水浴温度提高至40℃，反应仍缓慢;后加入氢化钠以改变反应条件，结果反应大大加速，收率得到很大提高，表明在反应条件中引入氢化钠可促进反应。

3.2 手性高效液相色谱法开发

本研究中，采用Daicel AD－H手性色谱柱建立了正相色谱条件下分离3－奎宁醇苯甲酰氯衍生物对映异构体的方法，该方法简单、方便，在开发过程中考察了有机改性剂对手性分离的影响。结果显示，流动相中添加0.1%二乙胺后，一对对映异构体色谱峰拖尾明显改善，峰形较对称;流动相中添加0.1%三氟乙酸后无明显变化;流动相中同时添加0.1%二乙胺和0.1%三氟乙酸后，一对对映异构体色谱峰与单独添加0.1%二乙胺所产生的色谱峰几乎无差别。故本试验选择正己烷－乙醇－二乙胺(80∶20∶0.1)为流动相。

本试验中通过(R，S)－3－奎宁环醇苯甲酰氯衍生化，使(R，S)－3－奎宁环醇能够用紫外检测器进行检测，引入的苯甲酰基团增强了其手性中心对手性色谱柱填料的辨识能力，使(R，S)－3－奎宁环醇的一对对映异构体 R－3－奎宁环醇和(S)－奎宁环醇在Daicel AD－H手性色谱柱上达到良好分离，建立了一种准确、可靠的测定 R－3－奎宁环醇光学纯度的手性高效液相色谱法。

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