王珊珊+徐海洋+王世明

摘要： 利用酿酒酵母高效的同源重组能力，通过PCR扩增技术，将复制子pBBR1片段、KanR（卡纳霉素抗性）片段、酵母复制子2 μ片段这3个两端含有30 bp同源臂的片段电转入酿酒酵母，通过同源重组获得宿主更具广谱性的革兰氏阴性细菌-啤酒酵母穿梭质粒pXZ200。经检测，pXZ200能够在恶臭假单胞杆菌KT2440和大肠杆菌中稳定复制。

关键词： 酿酒酵母；同源重组；穿梭质粒；PCR技术；pXZ200

中图分类号： Q936 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）08-0031-03

分子生物学中，利用DNA重组技术使宿主细胞获得某种特殊能力是非常重要而且被广泛利用的方法。然而，这种方法在体外需要经多步的酶切和酶连，很大程度上依赖于载体上限制性核酸内切酶的酶切位点，步骤繁琐，所连接片段一般限于几个kbp大小，很少超过10 kbp，但同源重组的新方法克服了这种限制。

酿酒酵母细胞内有着较其他生物更高效的同源重组修复双链DNA断裂机制，是研究同源重组机制和应用同源重组技术的主要模式生物 [1-2]。在酿酒酵母系统中，15 bp的同源序列就可以介导同源重组的发生，获得重组克隆 [3]；当两端的同源序列为30 bp时，有效同源重组的频率可接近80% [4-5]。PCR介导重组技术是指通过人工合成寡核苷酸单链作为PCR引物，用PCR扩增方法得到重组片段的两端带有重组所需同源臂外源的DNA片段 [6-7]，是目前应用最为广泛的一种重组技术 [4，8-10]，这种方法与传统酶切酶连的基因克隆方法相比，具有很多优点：省去了多步的酶切酶连，操作更为简单快捷；不依赖于限制性酶切位点的存在，不会引入多余的碱基；……