唐瑶　杜丹丹　彭东生等

摘要： 将日本[XCZ67 tif，JZ]暴露于不同浓度（0、0 025、0 05、0 5、1 0、2 5、5 0 mg/L）醋酸铅中，于处理后0、1、3、5、7、10、15、30 d 取血，测定其血清中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性及过氧化代谢产物丙二醛含量；并于胁迫30 d测定鳃、肝胰腺、肌肉、卵巢中的铅含量，以研究铅胁迫对日本[XCZ67 tif，JZ]免疫能力及组织蓄积的影响。结果表明，在铅胁迫下，日本[XCZ67 tif，JZ]超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性均呈先增强后减弱趋势，且中高浓度铅胁迫对抗氧化酶活性的诱导速度比低浓度快。胁迫30 d，除0 025 mg/L组外，各试验组2种酶活性均显著弱于对照组，且与铅胁迫质量浓度呈显著负相关（P<0 05）。0 025 mg/L组丙二醛含量无明显变化，其他各试验组丙二醛含量呈2种变化趋势，即0 05、0 5、1 0 mg/L组先升后降再升，2 5、5 0 mg/L组持续上升。胁迫15 d，除0 025 mg/L组外，各试验组丙二醛含量均显著高于对照组，且与铅胁迫质量浓度呈显著正相关（P<0 05）。铅在日本[XCZ67 tif，JZ]体内的积累以鳃和肝胰腺较多，而卵和肌肉在5 0 mg/L铅胁迫下仍仅有微量蓄积。鳃和肝胰腺中铅含量与胁迫浓度之间存在显著浓度效应（P<0 05）。可将日本[XCZ67 tif，JZ]血清超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量以及鳃、肝胰腺铅含量的长期变化作为铅污染的生物监测指标。

关键词： 铅胁迫；日本[XCZ67 tif，JZ]；免疫指标；组织蓄积

中图分类号： X171 5 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）08-0336-04

近年来，由于工农业废水的大量排放导致的重金属污染问题日益突出，对生态环境安全、人类食品安全及水产养殖业构成了较大威胁 [1-3]。铅是常见的重金属污染元素之一，其在人和动物体内长期蓄积会引起慢性中毒、神经机能紊乱、贫血甚至诱发癌症 [4]。日本[XCZ67 tif，JZ]（Charybdis japonica）广泛分布于我国各海区，营底栖生活，为经济价值较高的海水养殖蟹类 [5]。关于重金属对日本[XCZ67 tif，JZ]的影响已有少量研究报道，如张红霞等分析了重金属离子对日本[XCZ67 tif，JZ]血淋巴超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响 [6]；王春琳等探讨了硫酸铜蓄积对日本[XCZ67 tif，JZ]保护酶系统的影响 [7]；苗利军等对秦皇岛海域野生日本[XCZ67 tif，JZ]等9种海产品总汞含量进行了检测 [8]。本试验研究了不同浓度铅胁迫下，日本[XCZ67 tif，JZ]血清中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性以及脂质过氧化反应产物——丙二醛含量的变化，并分析了主要器官中铅的蓄积量，旨在探讨铅对日本[XCZ67 tif，JZ]的毒性作用，为养殖水质调控、海洋环境监测及相关毒理学研究提供参考。

1 材料与方法

1 1 试验材料

日本[XCZ67 tif，JZ]于2013年10月购自江苏省连云港市高公岛海滨，采用生态闭路循环养殖系统暂养7 d，暂养条件为：盐度2 5%，pH值8 0，水温15 ℃，自然光照，连续充气，日投喂2次鲜活贝类。选择附肢完整、活性强者用于试验，甲长为（516±0 28） cm，甲宽为（6 82±0 41） cm，体质量为（7659±1764） g。

1 2 试验设计

铅源采用醋酸铅，为国产分析纯。根据GB 11607—1989《渔业 水质标准》 （铅浓度≤0 05 mg/L）以及海水通常的铅污染浓度 [9]，醋酸铅浓度设7组：对照组（0 ）、低浓度组（0 025、0 05 mg/L）、中浓度组（0 5、1 0 mg/L）和高浓度组（2 5、5 0 mg/L），每组设3个平行，每个平行随机取27只蟹，饲养30 d。水温、投饵、充气等养殖条件与暂养时相同，每天定时换水2次，每次更换水体的50%，并维持各组醋酸铅质量浓度。

1 3 试验方法

于试验后0、1、3、5、7、10、15、30 d随机抽取3只/缸蟹采集血样。用无菌注射器先吸取ACD抗凝剂 [10]1 mL，再由蟹第三步足基关节处按1 ∶ 1比例抽取血淋巴，充分混匀， 5 000 r/min 冷冻离心10 min，取上清液即为血清，-80 ℃冷冻保存。30 d采集血样后，分别将各组标本冰冻麻醉后置冰盘上解剖，取出肝胰腺、肌肉、卵巢、鳃，用预冷重蒸水（0～4 ℃）冲洗，滤纸吸干水分，-80 ℃保存。

超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性、丙二醛含量和酶液蛋白含量采用南京建成生化试剂盒及美国BioTek Snergy HT型酶标仪测定。样品中铅含量采用日本岛津AA6300型原子吸收分光光度计测定。

1 4 数据分析

所测数据采用SPSS 16 0软件进行统计分析，进行单因子方差分析（One-Way ANOVA），LSD多重比较和Duncans检验，显著水平设为α=0 05。

2 结果与分析

2 1 铅胁迫对日本[XCZ68 tif，JZ]超氧化物歧化酶活性的影响

由图1可见，在铅胁迫下，各试验组超氧化物歧化酶活性均呈先增强后减弱趋势。胁迫1 d时，除0 025 mg/L组外，各试验组超氧化物歧化酶活性均受到显著诱导（P<0 05），其中以1 0、2 5 mg/L胁迫对超氧化物歧化酶活性的诱导效果较强。在低浓度组（0 025、0 05 mg/L），超氧化物歧化酶活性随胁迫时间延长而增强，分别于处理后10 d和7 d达到最高，随后呈减弱趋势。中浓度组（0 5、1 0 mg/L）和高浓度组（2 5、5 0 mg/L）超氧化物歧化酶活性最高值分别出现于 处理后5、3 d，其后持续减弱。至胁迫后15 d，浓度≤1 0 mg/L 的试验组超氧化物歧化酶活性仍显著强于对照组，而高浓度组活性显著减弱。胁迫30 d时，除0 025 mg/L组外，各试验组超氧化物歧化酶活性均显著弱于对照组，且与铅胁迫质量浓度呈显著负相关（r=-0 932，P<0 05）。endprint

2 2 铅胁迫对日本[XCZ68 tif，JZ]过氧化氢酶活性的影响

胁迫1 d时，除0 025 mg/L组外，各试验组过氧化氢酶活性均显著强于对照组（P<0 05），胁迫质量浓度≥1 0 mg/L 各组增强幅度较大（图2）。≥1 0 mg/L各组过氧化氢酶活性于5 d时增至最强，随后持续减弱。而低浓度组（0 025、0 05 mg/L）对过氧化氢酶活性诱导较慢，最高值分别出现于胁迫后10、7 d。胁迫30 d时，除0 025 mg/L组外，各试验组过氧化氢酶活性均显著弱于对照组，且与铅胁迫质量浓度呈显著负相关（r=-0 920，P<0 05）。

2 3 铅胁迫对日本[XCZ68 tif，JZ]丙二醛含量的影响

如图3所示，除0 025 mg/L组丙二醛含量无显著变化外，各试验组丙二醛含量呈2种变化趋势：0 05、0 5、1 0 mg/L 组丙二醛含量先增强后减弱再增强，而高浓度2 5、5 0 mg/L）组丙二醛含量表现为持续上升。胁迫1 d，≥0 5 mg/L组丙二醛含量显著高于对照组（P<0 05），以1 0 mg/L组上升幅度最大。0 05、0 5、1 0 mg/L组丙二醛含量于胁迫7 d时有所下降，随后又持续上升。胁迫15 d时，除0 025 mg/L组外，各试验组丙二醛含量均显著高于对照组（P<0 05），且与铅胁迫质量浓度呈显著正相关（r=0 918，P<0 05）。随着胁迫时间的延长，各试验组间丙二醛含量的差距逐渐增大，但组间规律未变。

2 4 铅胁迫对日本[XCZ68 tif，JZ]组织蓄积量的影响

从表1可以看出，铅在日本[XCZ67 tif，JZ]体内的积累以鳃最多，肝胰腺次之，而卵和肌肉即使在5 0 mg/L铅胁迫下仅有微量的蓄积。对照组在未添加外源性铅胁迫的条件下，仍能检测出微量铅。鳃和肝胰腺中铅含量与胁迫浓度之间均存在显著的浓度效应（P<0 05）。

3 结论与讨论

3 1 铅胁迫对日本[XCZ68 tif，JZ]免疫指标的影响

铅是一种不能降解且广泛存在的重金属污染物，其在生物体内的富集会严重损害机体的免疫防御系统，导致抗病力下降甚至死亡 [11-12]。当生物体受到铅等重金属污染物时，体内会产生大量的活性氧（ O-2[KG- 2]· ），造成机体的氧化损伤如酶蛋白失活、DNA断裂等 [13]。超氧化物歧化酶和过氧化氢酶是防御系统的关键酶，可联合清除活性氧自由基，防止过多的活性氧积存对机体造成氧化损伤 [14]。目前对抗氧化酶作为生物体氧化胁迫和损伤的标志物已进行了大量研究，但大多集中于铜、锌、镉等重金属 [15-16]，而关于铅对海洋动物免疫相关酶影响的报道相对较少。任虹等研究发现 5 0×10 -17～50×10 -10 mol/L铅对扁玉螺（Neverita didyma）过氧化氢酶有微弱的激活作用 [17]。王凡等报道铅胁迫下，牙鲆（Paralichthys olivaceus）过氧化氢酶活性变化表现为先抑制后增强再抑制 [18]。张红霞等研究表明，铅胁迫0 25 d时，日本[XCZ67 tif，JZ]血淋巴超氧化物歧化酶活性呈显著激活状态，随着胁迫时间的延长逐渐减弱，铅浓度≥2 5 mg/L试验组9 d后超氧化物歧化酶活性均显著弱于对照组，但未检出过氧化氢酶活性 [6]。本试验结果表明，铅胁迫对日本[XCZ67 tif，JZ]血清超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性呈现出明显的“短期诱导、长期抑制”的效应，且高浓度（≥2 5 mg/L）铅的诱导作用在胁迫早期迅速出现，低浓度（≤0 05 mg/L）铅的诱导则需要相对较长的暴露时间。铅胁迫30 d，铅浓度≥0 05 mg/L组2种酶活性均显著弱于对照组，表明铅的长期胁迫使日本[XCZ67 tif，JZ]抗氧化能力下降。

丙二醛是机体内脂质过氧化反应的重要产物，可与蛋白质的游离氨基作用，引起蛋白质分子内与分子间交联而导致细胞损伤 [19]。Company等研究发现，贻贝（Bathymodiolus azoricus）暴露在0 9 μmol/L 镉溶液里24 h后，鳃中丙二醛含量显著升高 [15]。本试验中，铅浓度≤1 0 mg/L组丙二醛含量先升后降再升，而高浓度胁迫组丙二醛含量持续上升，表明一定程度的铅胁迫可使日本[XCZ67 tif，JZ]抗氧化能力提高，减少丙二醛的产生，而低浓度铅长期胁迫或高浓度短期胁迫会破坏抗氧化系统，导致机体清除自由基能力降低，过多的活性氧使脂质过氧化程度加剧，丙二醛含量随之增加。

本研究中，铅胁迫30 d的日本[XCZ67 tif，JZ]超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性均与铅胁迫质量浓度呈显著负相关，以前者相关系数较大，且过氧化氢酶活性对铅胁迫的响应比超氧化物歧化酶活性略有滞后，而胁迫15 d的丙二醛含量即与铅胁迫质量浓度呈显著正相关，可将日本[XCZ67 tif，JZ]超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的长期变化作为铅污染的生物监测指标。

3 2 铅胁迫对日本[XCZ68 tif，JZ]组织蓄积的影响

与铜、镉等重金属相比，铅更易被某些海洋生物所累积，成为当前威胁海洋食品安全的主要因素之一 [20]。本研究中的对照组在未添加外源性铅胁迫的条件下，仍检测出微量铅，其中鳃和肝胰腺中的铅含量超过或接近GB 2762—2012《食品安全国家标准 食品中污染物限量》标准（0 5 mg/kg）。

赵元凤等将牙鲆暴露于铅环境中，其体内铅的蓄积量从多到少依次为内脏>鳃>肌肉 [21]；而王凡等发现，经过铅胁迫处理后的栉孔扇贝（Chlamys farreri）体内的铅蓄积量从多到少依次为鳃>内脏>肌肉 [22]。本试验中，铅在日本[XCZ67 tif，JZ]体内的积累规律与栉孔扇贝一致。鳃作为呼吸器官，与水体直接接触，铅较易进入鳃上皮中，造成鳃中铅含量迅速上升；而肝胰腺为重要的消化腺，积极地进行营养物质的分解代谢，同时也较易蓄积外源性重金属。王兰等以体腔注射法对中华绒螯蟹（Eriocheir siensises）给予镉胁迫，1 周后镉主要积累在肝胰腺和鳃中，而卵巢与肌肉几乎没有积累。其所采用的体腔注射法，使鳃未与镉直接接触，所以试验结果中肝胰腺的镉含量多于鳃 [23]。本研究发现，即使在高浓度铅胁迫下，日本[XCZ67 tif，JZ]卵和肌肉中仍仅有微量的蓄积，与前者报道规律相近。endprint

从本试验结果综合来看，在GB 11607—1989《国家渔业水质标准》上限水体（铅浓度0 05 mg/L）中，日本[XCZ67 tif，JZ]超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性明显减弱，且鳃和肝胰腺铅含量超过了GB 2762—2012《食品安全国家标准 食品中污染物限量》标准，这在养殖生产及水产品食用安全中不容忽视。高浓度铅胁迫会造成日本[XCZ67 tif，JZ]免疫酶活性大幅减弱，可能会导致养殖蟹的疾病暴发。可将日本[XCZ67 tif，JZ]血清超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量以及鳃、肝胰腺铅含量的长期变化作为铅污染的生物监测指标。

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