章芳　吴梦纤　王晓亮等

摘要： 本研究采用菌落稀释平板法和MPN-Griess 法结合Pearson 相关分析法，选取玛纳斯湿地6种不同植被（高山蒿草、草甸、芦苇、沼泽、灌木、柽柳湿地）群落生长的湿地土壤作为样地，对各样地的土壤微生物生理类群数量的季节动态及其与土壤环境因子进行相关分析。结果发现，土壤微生物生理类群的数量从大到小依次为氨化细菌>反硝化细菌>固氮菌>亚硝酸细菌>硝酸细菌。土壤微生物生理类群随季节动态变化总体趋势为：亚硝酸细菌与硝酸细菌数量为5月>9月>7月>11月，氨化细菌和固氮菌的数量为9月>7月>5月>11月，反硝化细菌数量为5月>7月>9月>11月。从土层垂直分布来看，土壤微生物生理类群数量0～10 cm土层大于10～20 cm土层。各细菌生理类群与不同的土壤环境因子呈不同显著水平的正相关或负相关。以上结果表明玛纳斯湿地不同植被类型和不同土层中细菌生理类群数量的分布均存在显著差异，且与土壤环境因子呈正相关或负相关。

关键词： 玛纳斯；湿地；土壤细菌生理类群；数量；土壤环境

中图分类号： S154 3 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2015）08-0327-06

湿地是人类赖以生存的家园、生物超市和重要的物种基因库，是自然界赋予人类的生态景观，它具有高度的生物多样性和巨大的生态与环境功能，有着“地球之肾”的美名。湿地对污染物的自净能力很强，通过复杂的界面过程和湿地动植物、微生物的共同作用，吸附、沉降、吸收、分解水中的污染物和悬浮物，对水体起净化作用 [1]。玛河流域湿地（简称玛河）地处我国第二大沙漠-古尔班通古特沙漠的南缘，属干旱半干旱地区，生态环境较为脆弱。玛河湿地位于绿洲经济带腹地，其生态区位极为重要，不仅改善着当地及周边区域的生态环境，还对绿洲区农业生产、社会经济发展起积极的促进作用。

土壤微生物是湿地土壤生态系统的分解者，通过不同的方式改变土壤的理化特性，是植物营养转化、有机碳代谢及污染物降解的驱动力，不仅推动了湿地生态系统的物质循环和能量流动，而且在湿地生物多样性维护、生态平衡等方面均有十分重要的作用 [2]。近年来，对于土壤微生物的研究主要集中在土壤微生物与植被的关系、土壤微生物季节动态等方面 [3-4]，而对土壤微生物生理功能群的研究相对较少。土壤微生物生理类群数量能直接反映所处生境的特征，研究湿地生态系统土壤细菌生理类群动态变化，有助于了解细菌生理类群多样性 [5]及深入探讨湿地生态系统结构和功能 [6-9]。开展退化湿地生态环境恢复重建是国家生态环境建设的重要需要，研究生态因子对微生物的影响受到广泛关注 [10]，而细菌生理类群与土壤理化因子相关性等方面的研究倍受瞩目，并取得高度进展。研究玛河不同植被类型土壤细菌生理类群随季节动态变化及与不同土壤理化因子的相关性，为合理开发利用微生物资源和保护湿地提供理论依据。

1 材料与方法

1 1 研究区概况及样点的基本特征

玛纳斯国家湿地公园位于玛纳斯县中部，位于亚洲大陆腹地 （43°03′～46°03′N，84°48′～86°42′E），是国家级湿地保护区，国家AA级景区。研究区新疆玛纳斯河国家湿地公园规划区中部有三大蓄水水库，并有小型水库、鱼塘、沼泽、芦苇滩沟通水系。其保护规划总面积47 02 km2 其中鱼塘 0 38 km2、 水库12 53 km2、河滩地8 81 km2、林地5 87 km2、居民社会用地0 26 km2。属干旱半干旱温带大陆型气候，主要特征为干旱少雨，热量丰富，日照充足，四季分明，冬季严寒，夏季酷热，降水量少，空气干燥。年均气温为6 8～7 1 ℃， 年均日照时数为2 886 h，年均降水量205 7 mm，年均蒸发量 1 648 4 mm，相当于降水量的4～11倍。海拔350～650 m，玛河湿地内土壤为灰漠土、灌淤土、潮土、草甸土和沼泽土等。湿地内有芦苇、沼泽、柽柳、草甸和各种蒿类等盐生植被。

1 2 土样采集

2013年5月、7月、9月、11月中旬以植被特征为依据，选取具有代表性蒿草、草甸、芦苇、沼泽、灌木和柽柳为样地（表1）。去除地表动植物残体，样品采集采用正方形5点取样法，垂直取0～10、10～20 cm深度的土壤，每个点取样量大体一致，将同一层的土样混合均匀后做好标记装入灭菌封口聚乙烯袋中，共采集土壤样品48个，低温保存带回试验室，4 ℃保存。

1 3 土壤功能细菌分离培养计数

氨化细菌采用蛋白胨液体培养基，固氮菌用改良瓦克斯曼77号培养基，硝化细菌采用改良的斯蒂芬逊培养基，反硝化细菌采用改良的阿须贝无氮培养基。芽孢杆菌、固氮细菌采用稀释平板混菌法，即取0 1 mL适宜浓度土壤稀释液加入空培养皿中，待培养基冷却到50 ℃左右，倒入培养皿与稀释液混合，每处理3个重复，固氮细菌置于28 ℃条件下培养 7 d；氨化细菌、亚硝酸细菌、硝酸细菌和反硝化细菌计数采用最大或然数（MPN）法计数，即吸取1 mL不同浓度的土壤稀释液加入到已制备好的各种液体培养基中，每处理5个重复，置于28 ℃条件下培养7～14 d后观测结果。

[JZ]1 g干土中菌数=（菌落平均数×稀释倍数）/干土质量。

1 4 土壤理化性状分析

土壤含水量的测定采用烘干法，pH值测定采用pH计（上海精科，pH S-3C），电导率采用电导仪（上海精科，DJ-320），有机质含量的测定用重铬酸钾容量法-外加热法，全氮含量的测定采用凯氏法，全磷含量的测定采用氢氧化钠消煮-钼锑抗比色法，全钾含量的测定采用NaOH熔融-火焰光度计法 [11-12]。

1 5 数据统计分析

试验相关数据均采用 Origin 8 0和SPSS 17 0软件进行统计分析。

2 结果与分析endprint

2 1 不同季节不同土层细菌生理类群数量动态分析

2 1 1 土壤氨化细菌的数量变化

从图1、图2可以看出，氨化细菌的数量最大达到1 73亿CFU/g，0～10 cm土层中除了灌木湿地氨化细菌数量5月到7月下降，9月又有所回 升，11月达到最大，即11月>9月>5月>7月。 柽柳湿地（0～10 cm土层）氨化细菌数量5月到7月下降，9月上升11月又开始减少外，即9月>11月>5月>7月，其他样地均表现为前3个月逐渐上升，11月开始下降，呈倒“V”字形，即9月>7月>5月>11月，表明在水分适宜、通气良好的土壤中，氨化细菌数量随温度的升高而增加。

2 1 2 土壤固氮菌的数量变化

从图3、图4可以看出，固氮菌的数量最高达到17 4万CFU/g，固氮菌的数量随季节变化而变化，各样地之间除了芦苇湿地和沼泽湿地，7月数量达到最大之后又呈下降趋势外，即7月>5月>9月>11月，其他样地均是9月固氮菌数量达到最大，11月又开始下降，即9月>7月>5月>11月。

2 1 3 土壤亚硝酸细菌的数量变化

由图5、图6可以看出，亚硝酸细菌是数量最高达到17 6万CFU/g，土壤亚硝酸细菌数量随季节变化而变化，除了灌木样地亚硝酸细菌数量7月达到最大，9月又开始下降外，其他样地均是5月亚硝酸细菌数量达到最大，7月下降，9月又随之上升，即5月>9月>7月>11月。

2 1 4 土壤硝酸细菌的数量变化

如图7、图8所示，硝酸细菌的数量最高达到1 51万CFU/g，与亚硝酸细菌数量的季节动态分布趋势相同，除了灌木样地硝酸细菌数量7月达到最大，9月又开始下降外，其他样地均是5月硝酸细菌数量达到最大，7月下降，9月又随之上升，即5月>9月>7月>11月。

2 1 5 反硝化细菌的数量变化

由图9、图10可以看出，反硝[CM（25]化细菌的数量最高达到988万CFU/g，反硝化细菌数量随季节变化而变化，除了灌木样地7月达到最大，5月最小外，其他样地均表现为5月最大、11月最小。

2 2 湿地类型与与细菌生理类群分析

5月0～10 cm土层的土壤中氨化细菌数量从大到小依次为高山蒿草湿地>柽柳湿地>灌木湿地>草甸湿地>沼泽湿[CM（25]地>芦苇湿地；固氮菌数量从大到小依次为芦苇湿地>柽柳湿地>沼泽湿地>高山蒿草湿地>草甸湿地>灌木湿地。数量柽柳湿地>高山蒿草湿地 >草甸湿地>灌木湿地>芦苇湿地>沼泽湿地；硝酸细菌数量从大到小依次为柽柳湿地>高山蒿草湿地>芦苇湿地>灌木湿地>沼泽湿地>草甸湿地；反硝化细菌数量从大到小依次为柽柳湿地>高山蒿草湿地>草甸湿地>芦苇湿地>沼泽湿地>灌木湿地。土壤微生物生理功能类群数量总体表现为高山蒿草数量最多，柽柳湿地次之，其后灌木、草甸，芦苇和沼泽最少。

2 3 不同湿地土壤理化因子方差分析

玛河湿地不同植被类型土壤pH值、电导率、含水量、有机质含量、全氮含量、全磷含量、全钾含量分别为7 61～903、0 16～6 53 mS/cm、6 17%～35 64%、19 22～43 09 g/kg、0 90～215 g/kg、0 79～2 24 g/kg、5 87～15 27 g/kg，除含水量和全钾含量外，高山蒿草样地最高，芦苇和沼泽样地较低（表2）。pH值的变化趋势（除芦苇和沼泽样地外）为：9月达到最高，5月和11月pH值最小，且差异均不显著；含水量的变化趋势为：7月达到最大随后逐渐降低，沼泽样地季节间差异极显著，灌木样地除11月外，其他季节间差异显著；电导率的变化趋势（除芦苇和草甸样地外）为：5月最大、11月最小，柽柳样地季节间（除9月）差异显著；有机质的变化趋势为（除芦苇样地外）：5月最大，随后呈逐渐降低的趋势，柽柳样地季节间差异极显著；全氮含量（除草甸样地）随季节变化均呈逐渐降低的趋势，5月最大、11月最小，高山蒿草样地季节间（除7月）差异显著；各样地的全磷含量均随季节变化呈下降的趋势，高山蒿草样地季节间（除7月）差异极显著；各样地的全钾含量均随季节变化呈下降的趋势且季节间差异不显著。

2 4 湿地土壤微生物生理功能群与土壤环境因子之间的Pearson相关性

氨化细菌与pH值、全氮含量、全钾含量呈显著正相关；亚硝酸细菌、硝酸细菌与土壤有机质含量、全氮含量、全磷含量和全钾含量呈极显著正相关，亚硝酸细菌与含水量呈极显著负相关，与pH值呈显著正相关；反硝化细菌与pH值、有机质含量、全氮含量、全磷含量、全钾含量呈极显著正相关；固氮细菌与各种理化因子相关性不显著（表3）。

3 结论与讨论

3 1 不同植被细菌生理功能群数量差异

不同植被类型下土壤细菌生理群的数量分布存在一定的差异，可能是由于不同植被类型的植被结构组成和种类不同，植被盖度和根系的发达程度不同，生长环境也不尽相同，使好氧菌和厌氧菌在数量上存在差异。Salkum等在研究人工湿地植物根系对微生物代谢多样性的影响时发现，表层土壤受植物根系及植被凋落物的影响，有机物种类多、含量丰富，微生物代谢多样性也较高 [13]。Davit等比较了新泽西州生长芦苇和互花米草（Sparteine grandiflorae）不受人类活动干扰的自然湿地与一处受人类活动干扰的湿地中微生物群落多样性，发现种植芦苇和互花米草的自然湿地生态系统中微生物群落结构不同 [14]。因此，自然湿地生态系统中，微生物的群落组成直接受植被类型的影响。正如本试验结果所示，虽然芦苇有发达的通气组织，在某种程度上增加了土壤的通气量，但常年积水使土壤含水量过高，导致容重增加、孔隙度减少，从而降低了土壤的透气性，导致土壤的含氧量降低。大多数土壤微生物是异养型好氧微生物，通过有氧呼吸分解有机物产能，土壤含氧量是限制芦苇和沼泽土壤微生物生长的主要原因。endprint

3 2 不同土层不同季节细菌生理功能群数量差异

研究表明，细菌生理类群的数量在同一样地不同土层不同时期发生较大变化，且不同样地类型间的差别也较大。从不同湿地类型主要生理类群的垂直分布看，芽胞杆菌、氨化细菌、固氮菌、亚硝酸细菌、硝酸细菌数量基本表现为随土层深度的增加呈下降的趋势，且数量分布情况为氨化细菌>反硝化细菌>亚硝酸细菌>固氮菌>硝酸细菌。徐惠风等对乌拉苔草湿地土壤微生物进行研究时发现，土壤细菌在春、夏、秋3个季节中的变化趋势基本一致，都呈现出0～90 cm剖面中从上而下急剧减少的趋势 [15]。从季节变化的分布看，细菌春季数量最多，秋季次之，夏季和冬季较少，这与Kaiser等的报道 [16-17]一致。固氮菌分布趋势分析认为由于气温不断升高，降水量增加，湿度也不断增加，导致土壤中的微生物活性逐渐增强，数量迅速增加。此外，植物开始生长，根际代谢物和分泌物不断增加，有效刺激了固氮菌的数量增长。11月气温急剧下降并开始结冰，抑制了固氮菌的活动，同时也由于玛河湿地独特的干旱半干旱气候，冬季长，导致固氮微生物处于休眠或半休眠状况，分解含氮有机物质的能力减弱，7月、8月随气温的升高土壤中的微生物活性不断增强、数量迅速增加。Munch等研究发现，植物根系将氧气输送至根区并释放分泌物，为微生物提供养分，与没有生长植物的湿地土壤相比，植物覆盖的湿地土壤，根系周围微生物总量及群落结构多样性都很高 [18]。此外，由于植物体内磷含量的增加，导致植物根系细胞膜渗透性降低、根系分泌物成分发生变化或分泌物的数量下降都会抑制硝化细菌的活性。赵先丽等对芦苇湿地土壤微生物的研究发现，土壤偏盐碱性更有利于细菌大量繁殖，土壤微生物群落结构大程度上受土壤有机物降解、土壤污染物代谢、土壤团聚体形成以及土壤营养物质循环等影响，且不同土层通气状况不同，从而导致氧浓度的变化使不同土层中土壤微生物数量发生明显变化，这与本试验结果基本一致 [19]。不同微生物群落结构的差异和很多因素有关，如温度、pH值、土壤各种理化性质、溶氧量、土壤肥力、植物根系的作用等 [20]。

3 3 细菌生理类群与土壤环境因子相关性分析

不同细菌生理类群在土壤水分、土壤温度、土壤pH值、电导率、有机质和矿质等因子上都有显著差异，可能由于不同植被群落结构和组成不同且土壤营养成分存在差异，微生物主要以植物残体为营养源，植物的质和量必然导致土壤细菌生理类群在土壤中的分布的不均匀。此外，可能是不同的细菌生理群代谢和繁殖周期各异，导致利用营养物质的量和顺序有差异。本研究发现，亚硝酸细菌与有机质含量、全氮含量呈极显著正相关，这与陈登稳等的研究结果 [20-21]一致，但本研究结果与文都日乐等的亚硝酸细菌与含水量呈正相关的结果相反，pH值与亚硝酸细菌呈显著正相关与袁飞的结果 [22]一致。反硝化细菌与有机质、全氮含量呈显著正相关，与丁玲玲等的研究结果 [23]一致。本研究结果表明固氮细菌与理化因子无相关性，不同学者报道结果的差异可能与研究地点的气候和植物群落等有关。

研究土壤微生物最终的目的是为了了解微生物在湿地生态系统演替中发挥的作用，以维持绿洲生态系统平衡、涵养水源、储藏微生物基因资源等方面起着重要作用。微生物在促进物质循环和能量流动的转化中起决定性作用，氮循环过程包括：固氮细菌把空气中的N2转化为NH+4供植物合成有机氮，补充土壤中的氮元素；氨化细菌将NH+4硝化为NO-3，其中亚硝酸细菌将NH+4氧化成NO-2，硝酸细菌NO-2氧化成NO-3，反硝化细菌将NO-3转化为N2完成氮素循环 [24]。由于硝化作用与反硝化作用相连增加氮素损失，但土壤中的自生固氮菌通过生物固氮补充了土壤中的氮素流失，还消除工业氮肥给经济和环境带来的压力，另一方面硝化过程会导致土壤酸化，使玛纳斯土壤盐渍化趋势得到缓解。

湿地土壤类型、土壤质地、土壤性质等因子对微生物功能群的分布和活性度具有重要影响。湿地土壤微生物各主要生理类群直接参与土壤中C、N等营养元素循环和能量流动，其数量和活性直接关系到土壤肥力 [25-26]。土壤微生物在土壤形成和发育过程中具有重要意义，因其在土壤质量演变过程中具有相对较高的转化能力，可较早地预测土壤有机质乃至土壤环境的变化过程，成为反映土壤动态变化以及土壤复退性能的一项重要指标 [27]。只有从湿地中分离出具有特殊功能并可实践于应用的微生物，才能更好地体现出湿地微生物的价值，本研究将继续系统全面地从玛河湿地土壤中分离出可培养的细菌并鉴定，全面评估玛河湿地土壤的微生物多样性，这对准确评估该湿地的生态功能和健全湿地保护具有重要意义。湿地微生物的研究方法从最初的传统分离培养法到当今广泛采用的分子生物学方法，如RFLP、PCR-DGGE、克隆文库，再到今天的高通量测序技术，技术水平的不断提高更有利于研究湿地微生物的群落结构和多样性。

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