王安平　朱善元　王永娟

摘要： 以血清1型鸭甲型肝炎病毒（DHAV-1） SH株 3C 基因为序列设计1对特异性引物，RT-PCR方法进行扩增，克隆入原核表达载体pET-32a，转化大肠杆菌BL21（DE3），在IPTG诱导下重组蛋白并获得成功表达，该重组蛋白分子量约为38 ku，能与多聚组氨酸标签单抗发生特异性反应。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠，制备重组蛋白的多抗血清，经Western-blot分析证明，制备的抗血清能够与DHAV-1感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。 3C 基因在大肠杆菌中可获得成功表达，制备的多抗血清可用于3C蛋白的检测。

关键词： 鸭甲型肝炎病毒； 3C 基因；原核表达；多抗

中图分类号： S858 32 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）08-0205-02

鸭病毒性肝炎（DHV）是一种急性、高度致死性病毒传染病，可引起21日龄以下的雏鸭发生急性肝炎，病死率高达100%，是严重危害养鸭业的疫病之一。鸭病毒性肝炎较早认为有3个血清型，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，国内外主要发生和流行的是Ⅰ型鸭肝炎病毒（DHV-Ⅰ） [1-2]。2005年7月，国际病毒分类委员会发表最新病毒分类第八次报告，认为DHV-Ⅱ和DHV-Ⅲ应归属于星状病毒科；而2008年后，将引起鸭甲型病毒性肝炎的病毒归属于小RNA病毒科的禽肝炎病毒属鸭甲型肝炎病毒种，并称之为鸭甲型肝炎病毒（DHAV），包括经典型（我国原Ⅰ型鸭肝炎病毒）、台湾新型、韩国新型3种亚型，分别为DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3 [3-5]，其中，DHAV-1呈世界性分布，是中国DHAV流行的主要血清型。

DHAV粒子呈二十面体对称，直径为20～40 nm，无囊膜，核心为单股正链的RNA，整个基因组约有7 690个核苷酸组成，不含5′帽子结构，3′端有poly（A）尾巴，只有1个较大的开放读码框，病毒RNA 指导合成1条完整的多聚蛋白。多聚蛋白在翻译过程中不断被自身编码的蛋白酶水解，分解成VP0、VP3、VP1 3个结构蛋白和2A1、2A2、2A3、2B、2C、3A、3B、3C、3D 9个非结构蛋白等。3C蛋白是具有水解多聚蛋白活性的蛋白水解酶，在多聚蛋白水解、病毒复制和形成过程中发挥重要的作用 [6-7]。目前，关于DHV主要集中于基因组序列测定与分型、结构蛋白表达及诊断制剂的研究，对于3C蛋白功能的研究还未见报道 [8-11]。本研究利用大肠杆菌转化系统表达DHAV-1 SH株的 3C 基因，制备其多抗血清，为3C蛋白的进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1 1 毒株、菌株和载体

DHAV-1 SH毒株，由中国上海兽医研究所惠赠；10日龄SPF鸡胚，购于江苏农牧科技职业技术学院国家水禽基因库；pET-32a载体、大肠杆菌BL21（DE3）和DH5α，均为江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室保存。

1 2 酶和相关试剂

Trizol试剂盒，购自TaKaRa公司；M-MLV反转录酶，购自Invitrogen公司；T4 DNA连接酶、BamHⅠ和SacⅠ，购于Fermentas 公司；His标签单抗、HRP-羊抗鼠IgG、质粒小提试 剂盒、DAB显色试剂盒，购于北京康为世纪生物科技有限公司；DNA胶回收试剂盒，购于爱思进生物技术（杭州）有限公司。

1 3 引物设计与合成

根据GenBank中发表的DHAV-1 SH株病毒基因组序列，设计 3C 基因序列的1对引物，引物序列为：F：5′-TTAGGATCCAGCGGGCGGGTGAATTTCA-3′（下划线为BamHⅠ酶切位点）、R：5′-GACGAGCTCTTGGTTAAAAACTGGAAAA-ACC-3′（下划线为SacⅠ酶切位点），由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

1 4 DHAV-1的增殖与病毒RNA提取

取10倍稀释的原代病毒0 2 mL接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，于37 ℃孵化箱孵化；选48～72 h死亡鸡胚，4 ℃ 过夜，收集尿囊液；参照说明书按Trizol法抽提尿囊液总RNA。

1 5 DHAV-1 3C 基因的扩增和测序

根据RT-PCR试剂盒说明书操作，反应程序：25 ℃ 10 min； 42 ℃ 90 min；70 ℃，10 min。 PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 延伸10 min。PCR产物进行0 8%琼脂糖凝胶电泳分析。

1 6 重组质粒载体pET-3C的构建

PCR 产物经0 8%琼脂糖凝胶电泳分离回收纯化，经BamHⅠ、SacⅠ酶切，与经同样酶切的pET-32a连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含100 μg/mL 氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂平板上37 ℃培养过夜；挑取单菌落，提取质粒电泳筛选，进行酶切鉴定，并送由上海英潍捷基生物技术有限公司测序，正确的克隆命名为pET-3C。

1 7 重组菌的诱导表达

将重组质粒pET-3C转化至BL21（DE3），挑取单菌落接种于5 mL含Amp抗性的 LB 液体培养基中，37 ℃ 振荡培养过夜；按 1% 接种量转接至含Amp的5 mL LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min 振荡培养，菌液D600 nm值达 0 4～1 0时，加入0 2～1 0 mmol/L IPTG，37 ℃诱导3～5 h；离心收集菌体，溶于适量PBS中，超声波裂解菌体，离心后分别收集上清及沉淀， -20 ℃ 保存备用。相同条件下诱导含表达质粒 pET-32a 的空载体及未加诱导剂的受体菌作为空白和阴性对照。

1 8 表达产物的检测

取200 μL经诱导的菌液，与50 μL 5×SDS上样缓冲液混匀，沸水煮沸3 min，SDS-PAGE凝胶电泳分析。将诱导样品和非诱导样品进行SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，以鼠抗His单抗作为一抗，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠为二抗，DAB显色试剂盒进行显色。

1 9 重组蛋白抗血清的制备

将重组蛋白经SDS-PAGE电泳，切出回收目的条带，加入少量PBS研磨匀浆化；皮下两点注射法免疫6周龄ICR小鼠，每隔2周免疫1次；4次免疫后第14天采血，分离血清，-80 ℃ 保存备用。

1 10 多抗血清的Western blot 鉴定

将DHAV-Ⅰ SH毒株鸡胚尿囊液进行SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，以制备的鼠多抗血清作为一抗，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠为二抗，DAB显色试剂盒进行显色。以未接种DHAV-1的鸡胚尿囊液作为阴性对照。

2 结果与分析

2 1 3C 基因的克隆

以提取的尿囊液总RNA为模板，RT-PCR扩增出约 550 bp 的目的条带。经BamHⅠ、SacⅠ双酶切获得约550、5 900 bp 2个条带（图1）；经进一步测序，克隆的 3C 基因序列及阅读框完全正确。

2 2 重组蛋白的诱导表达与检测

由图2可见，IPTG浓度为1 0 mmol/L，37 ℃诱导4～5 h，重组蛋白可得到较高水平表达，并都以包涵体形式存在，重组蛋白相对分子量约为38 ku。由图3可见，以抗His标签单抗对重组蛋白进行鉴定，在目的位置出现1条特异条带。

2 3 多抗血清的Western blot 鉴定

结果表明，获得的3C蛋白多抗血清不仅能与pET-3C重组菌诱导，发生重组蛋白反应，而且能与DHAV-Ⅰ SH毒株鸡胚尿囊液反应，形成3C蛋白大小约为20 ku的条带（图4）。

3 讨论

鸭甲型肝炎病毒归属于小RNA 病毒科的禽肝炎病毒属鸭甲型肝炎病毒种，与其他小核糖核酸病毒一样，病毒基因组只编码一个大的开放阅读框，翻译形成一多聚蛋白，需进一步剪切加工形成结构蛋白及病毒复制必须的功能蛋白。在鸭肝炎病毒蛋白加工过程中，3C蛋白是唯一起蛋白酶作用的蛋白，它可以将多聚蛋白加工成单个具有独立功能的病毒蛋白，在病毒复制及衣壳装配过程中起重要作用。

pET表达系统是目前使用较为广泛的一种原核表达系统，在诱导状态下，外源基因可以获得高效表达，表达量一般可以达到菌体总蛋白的30%以上。表达的融合蛋白带有组氨酸标签，方便目的蛋白的纯化，其肠激酶酶切位点可切除融合部分，有利于对目的蛋白的研究。本试验用pET-32a表达系统成功表达了DHAV-1 3C蛋白，采用RT-PCR技术扩增出完整的 3C 基因，经分析该基因长为543 bp，与DHAV-1 SH株序列同源性达100%，SDS-PAGE电泳证明表达的融合蛋白分子量约为38 ku。

尽管pET原核系统表达的外源蛋白缺少翻译加工功能，但表达产物依旧保持了良好的免疫原性。本试验利用表达的融合蛋白免 疫小鼠制备了针对重组蛋白的多抗血清，Western- blot分析说明制备的多抗血清可与DHAV-1尿囊液中的3C

蛋白发生特异性反应，制备的多抗血清具有很好的特异性，可作为检测用抗体进一步用于DHAV-1 3C抗原的检测及功能研究。

[HS2 3][HT8 5H]参考文献：

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