周颖　张艳明　江洁等

摘要： 通过对竹柏4种叶部真菌性病害进行病原鉴定，以期为竹柏的病害防治工作提供一定的参考依据。从广西南宁市良凤江国家森林公园苗圃基地、南宁市林业科学研究所标本园、博白县林业科学研究所、博白林场分别采集竹柏病叶标本，进行病原菌的分离和致病性测定，观察并描述病原菌的培养性状、形态特征，并通过rDNA-ITS PCR序列测定以确定病原菌。根据形态特征和rDNA-ITS序列分析将病害鉴定为藻斑病（致病菌为Cephaleuros virescens Kunze）、炭疽病（致病菌为Colletotrichum gloeosporioides）、叶尖枯病（致病菌为Pestalotiopsis longisetula）及叶枯病（致病菌为Alternaria tenuissima）。前2种病害为竹柏上已发生的病害，叶尖枯病、叶枯病为竹柏上发生的新病害。

关键词： 竹柏；叶部病害；病原菌；真菌；鉴定

中图分类号：S432.4+4 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2015）08-0125-03

竹柏（Podocarpus nagi）属罗汉松科罗汉松属竹柏组（Podocarpus Sect. Nageia Endl.） [1]。竹柏叶面光泽，形态宁静雅致，又是四季常青的树种，因而常作为常绿观赏树种、行道树以及庭院绿化美化的良好树种 [2]。因其材质细致均匀、硬度中等，也可供建筑、家具、文具、工艺等用材，其种子可榨油并可食用或工业用 [3]。因此，作为一种集观赏价值、经济价值于一身的树种，依托竹柏而形成的产业发展前景可观。但是近年来，随着竹柏的种植面积不断扩大，竹柏真菌性病害日趋严重，已成为阻碍竹柏产业发展的一大重要因素，给竹柏生产带来了较为严重的经济损失。因此，对造成竹柏真菌性病害的病原进行鉴定，明确其病原菌种类，可为下一步防控竹柏真菌性病害打下基础，也对更好地保护和利用竹柏这一珍贵树种有积极意义。迄今为止，已报道的竹柏病害主要有炭疽病、叶枯病、藻斑病、斑枯病、叶尖枯、褐斑病、煤烟病等。段定仁等在广州省龙门县进行林木病虫害调查时发现竹柏上有以下病害发生：炭疽病（致病菌为Colletotrichum sp.）、藻斑病（致病菌为Cephaleuros virescens Kunze）、叶枯病（致病菌为Pestalotia sp.） [4]。广西林业局森林病虫普查办公室组织人员普查广西竹柏病害，报道竹柏炭疽病（致病菌为Gloeosporium sp.或Colletotrichum sp.）、叶尖枯病（致病菌为Phyllosticta sp.）、叶尖枯病（致病菌为Pestalotia sp.）、叶尖枯病（致病菌为Macrophoma sp.）、叶枯病（致病菌为Phyllosticta sp.）、藻斑病（致病菌为Cephaleuros virescens Kunze）、叶枯病（致病菌为Sphaerulina sp.）、叶枯病（致病菌为Guignardia sp.）、褐斑病（致病菌为Phoma sp.）、煤烟病（致病菌为Capnodium sp.） [5]。但上述报道内容也只简单介绍了竹柏的病害种类、病原名称及其分布情况，对病害的症状、发生规律及防治方法等方面未进行深入的研究。张中义等报道了Stagonospora luzulae（Westend.）Sacc.引起的竹柏斑枯病，简要介绍了其发病期、分布情况等，并进行了症状描述 [6]。周建良对竹柏炭疽病进行调查并将其病原菌初步鉴定为胶孢炭疽菌 [2]，但该研究仅限于形态学鉴定，并未通过分子手段加以辅助鉴定。韦继光等研究发现，竹柏叶片组织内存在内生拟盘多毛孢，并发现内生拟盘多毛孢在一定条件下也可转变为病原拟盘多毛孢，如受伤、接近衰亡且湿度很高等情况，从而导致竹柏出现叶斑病 [7]。随着科技手段的不断创新及新技术的发展，分子鉴定已成为病原鉴定的一大重要手段，利用诸如rDNA-ITS 序列分析的分子鉴定手段与形态学相结合的方法，使得病原菌的鉴定工作变得比以往更加精确而高效，也使得以往单纯依靠形态学鉴定而造成的分类混乱等状况得以改善。竹柏作为具有较高观赏价值、经济价值和生态效应的珍贵树种，近年来其病害种类逐渐增多，个别病害发生较为严重，已经危害到了竹柏相关产业的发展。但近年来关于竹柏的病害研究相对较少，竹柏病害未引起研究者们的足够重视。通过组织分离法分离竹柏受害叶片中的真菌，并测定其致病性，最后，结合形态学和rDNA-ITS序列分析方法确定病原菌的分类地位，以期为竹柏叶部真菌性病害的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

病原菌菌株分别采用分离自广西南宁市良凤江国家森林公园苗圃基地、南宁市林业科学研究所标本园、博白县林业科学研究所、博白林场的竹柏病叶。供致病性测定的苗木取自广西南宁市良凤江国家森林公园苗圃基地。供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基，即PDA培养基，其制作方法参照方中达的《植病研究方法》中描述的PDA制作方法 [8]。主要试剂和仪器：新型植物基因组DNA提取试剂盒（Nuclean PlantGen DNA Kit 50）、2×ES Taq MasterMix（含染料），北京康为世纪生物科技有限公司；真菌核糖体rDNA ITS的通用引物ITS 4和ITS 5；DM1000 DNA Marker；离心机、涡旋振荡器、电泳仪、凝胶成像仪、PCR仪等。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离与形态学鉴定 （1）对不同症状的病害标本进行镜检，对于观察不到病原菌的病叶可将其放入保湿器中保湿2～3 d后再镜检。（2）病原菌的分离：采用75%乙醇中浸泡10 s、0.1%的氯化汞溶液浸泡2 min、无菌水浸洗3次的消毒方法进行病害标本的组织分离。（3）致病性测定：采用菌饼活体接种方法，设叶片刺伤、无伤接种2种处理，空白对照组采用空白琼脂块接种。每个处理均接种20张健康叶片，于 25 ℃左右保湿培养，每天进行观察并记录发病情况。对于发病的叶片，根据柯赫氏法则，对发病部位进行病原再分离。（4）病原菌形态观察：将菌株转接于PDA平板上，于 25 ℃ 培养箱培养7～8 d，观察并记录菌落相态特征。采用插片法，待其产孢后，于光学显微镜下观察并记录其菌丝特征、分生孢子形态等，测量分生孢子的大小。

1.2.2 rDNA-ITS序列分析与鉴定 （1）DNA的提取：根据北京康为世纪生物科技有限公司提供的新型植物基因组DNA提取试剂盒使用方法提取病原菌的DNA。（2）rDNA-ITS PCR扩增及程序：PCR扩增反应体系：2×ES Taq MasterMix（5 U/μL） 25 μL，ITS 4 （4 μmol/L）2 μL，ITS 5 （4 μmol/L） 2 μL，Template DNA 2 μL，ddH2O 19 μL，反应总体积50 μL。PCR反应程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃ 2 min。（3）电泳凝胶成像后，选取有条带的PCR产物送到生工生物工程（上海）股份有限公司测序。（4）登陆GenBank数据库，将所得序列与数据库中相关序列进行同源性比对。

2 结果与分析

通过鉴定，初步探明了4种竹柏叶部真菌性病害，分别是藻斑病（致病菌为Cephaleuros virescens）、炭疽病（致病菌为Colletotrichum gloeosporioides）、叶尖枯病（致病菌为Pestalotiopsis longisetula）及叶枯病（致病菌为Alternaria tenuissima）。其中后2种病害为竹柏新病害。

2.1 藻斑病

藻斑病主要危害竹柏叶片。病斑圆形或椭圆形，中心部分呈灰白或黄褐色。叶病部粗糙，稍隆起，有时着生毡状物。在显微镜下观察该病病原菌，其孢子囊梗呈簇状生长，基部紧挨在一起，上部分散开，不分枝。其顶端膨大成支持细胞，上生1至数个小梗，每个小梗顶端着生1个孢子囊，孢子囊呈圆形或椭圆形，直径12.50～31.25 μm（图1）。

2.2 炭疽病

2.2.1 田间危害症状 3个采集地点均有炭疽病发生，该病主要危害竹柏的叶片，一般从叶尖部、叶缘或叶子的中部发病。病斑呈褐色、灰褐色、灰色，其上密生有一些黑褐色或黑色的颗粒状物，病健交界处明显。根据病斑颜色，大致分为2类：（1）病斑褐色，受害叶片从病健交界处起，往病菌最初侵染部位的方向，往往会有长1 cm、颜色呈土褐色的条带，该部位在湿度大的培养条件下会产生菊黄色的孢子堆，个别病斑上会有轮纹；（2）病斑灰色，病健交界处呈紫黑色或褐色，该类病斑一般出现在老叶或是成年竹柏叶片上。该病为害植株严重时，会导致整株叶片变枯，最终整棵植株死亡（图2）。

2.2.2 致病性测定 叶片接种菌饼后，刺伤接种的叶片于第3天开始发病，第4天发病率达到100%。无伤接种的叶片于第5天也未见发病。空白对照组接种琼脂块叶片无任何症状。试验组叶片发病部位呈褐色，与田间发病部位症状一致。根据科赫氏法则，再次从致病性试验中的发病叶片分离该菌，回接到新鲜健康叶片后叶片发病，确定该菌为病原菌（图3）。

2.2.3 病原鉴定 在PDA培养基平板上于25 ℃恒温条件下培养该菌，其菌落为圆形，颜色为白色或灰白色，边缘整齐，气生菌丝绒毛状。分生孢子长椭圆或椭圆形，无色，单胞，两端钝圆或1钝1略尖，内含1～2个油球，大小为（13.75～1875） μm×（3.75～6.25） μm。该病原菌分离率为66.7% 。经测序，竹柏炭疽病病原菌 rDNA-ITS 片段长度为566 bp。将菌株的rDNA-ITS序列与NCBI中已有的相关菌株的rDNA-ITS序列进行同源性比较，结果表明竹柏炭疽病的病原菌与Colletotrichum gloeosporioides（GenBank No.KF938897.1）的同源性最高，为99%，此结果与形态鉴定结果一致。根据其形态特征及rDNA-ITS序列分析，鉴定该病原菌为Colletotrichum gloeosporioides（图4）。

2.3 叶尖枯病

2.3.1 田间症状 在良凤江国家森林公园苗圃基地、博白林科所2个采集地点均有叶尖枯病发生，拟盘多毛孢引起的竹柏叶尖枯病的症状和炭疽菌引起的竹柏炭疽病的第1类症状相似，常常从叶尖开始发病，沿着叶柄方向不断延伸扩展。病斑为黄褐色，其正反面均生有一些黑褐色的颗粒状物，没有轮纹。从发病较早的部位到刚发病的部位，颜色逐级加深，即黄褐色、褐色、深褐色；病健交界处明显，呈褐色（图5）。

2.3.2 致病性测定 叶片接种菌饼后，刺伤接种的叶片24 h内就开始发病，第3天发病率达到100%。无伤接种的叶片未见发病。空白对照组接种琼脂块叶片无任何症状。试验组叶片发病部位呈褐色，与田间发病部位症状一致。根据科赫氏法则，再次从致病性试验中的发病叶片分离该菌，回接到新鲜健康叶片后叶片发病，确定该菌为病原菌（图6）。

2.3.3 病原鉴定 在PDA培养基平板上于25 ℃恒温条件下培养该菌，其菌落呈较为明显的轮纹状，菌丝为白色或无色，分生孢子纺锤形，具4个隔膜，两端细，中间3个细胞黑褐色至黑 色，两端细胞无色，分生孢子大小为（18.75～25.00） μm× （5.00～7.50） μm，顶端细胞上生有2～3根附属丝。该病原菌的分离率为73.3%。经测序，竹柏叶尖枯病病原菌 rDNA-ITS 片段长度为546 bp。将菌株的rDNA-ITS序列与NCBI中已有的相关菌株的rDNA-ITS序列进行同源性比较，结果表明其与Pestalotiopsis longisetula（GenBank 登录号AF409971.1）的同源性最高，为99%，此结果与形态鉴定结果一致。根据rDNA-ITS序列分析，鉴定该病病原菌为Pestalotiopsis longisetula（图7）。

2.4 叶枯病

2.4.1 田间症状 在良凤江国家森林公园苗圃基地采集点有叶枯病发生，该病菌可从叶尖、叶的中部侵染发病。病斑红褐色或黄褐色， 病健交界处较为明显；病斑上干净光滑；发病部位略有皱缩，导致叶片略扭曲（图8）。

开始发病，第4天发病率达到100%。无伤接种的叶片未见发病。空白对照组接种琼脂块叶片无任何症状。试验组叶片发病部位呈褐色，与田间发病部位症状一致。根据科赫氏法则，再次从致病性试验中的发病叶片分离该菌，回接到新鲜健康叶片后叶片发病。根据以上试验结果，确定该菌为病原菌（图9）。

[FK（W11][TPZY99.TIF]

2.4.3 病原鉴定 在PDA培养基平板上于25 ℃恒温条件下培养该菌，其菌落青灰色至灰褐色，背面褐色，气生菌丝发达，分生孢子倒梨形或倒棒状，黄褐色，具横隔2～7个，纵隔0～2个，分隔处略有缢缩，尤其是孢身中部的横隔明显较粗厚。分生孢子大小为（25～40） μm×（6.25～12.50） μm，该病原菌的分离率为65%。经测序，竹柏叶枯病病原菌 rDNA-ITS 片段长度为550 bp。将菌株的rDNA-ITS序列与NCBI中已有的相关菌株的rDNA-ITS序列进行同源性比较，结果表明其与Alternaria tenuissima（GenBank 登录号EF031053.1）的同源性最高，为99%，此结果与形态鉴定结果一致。根据形态鉴定结果与rDNA-ITS序列分析，鉴定该病病原菌为Alternaria tenuissima（图10）。

[FK（W7][TPZY110.TIF]

3 讨论

本研究鉴定了竹柏上发生的4种叶部真菌性病害，初步探明了引起竹柏藻斑病、炭疽病、叶尖枯病、叶枯病的病原分别为Cephaleuros virescens Kunze、Colletotrichum gloeosporioides、Pestalotiopsis longisetula、Alternaria tenuissima。其中，竹柏藻斑病、炭疽病的病原鉴定结果与前人研究结果一致。此外，由于

试验条件、技术等限制因素，竹柏病害的早期研究多停留在病原菌的形态学鉴定，所以，大多研究只能将病原鉴定到属。随着科学技术的发展，分子技术已成为病原鉴定的重要手段之一。目前，采用形态学加分子生物学的方法鉴定病原菌的模式已被广大研究者所采用，较之传统的病原菌鉴定方法，以分子生物学方法作为辅助鉴定的手段，避免了在研究过程中因病原菌的形态特征易受环境条件或其他人为干扰而发生改变而使鉴定准确度降低的问题，使所得结果更为可靠。本研究在传统的形态学鉴定基础上，以rDNA-ITS序列分析作为辅助鉴定手段，将竹柏叶尖枯病和叶枯病的病原菌初步鉴定到种，这提高了鉴定结果的可信度。

Alternaria sp.、Pestalotiopsis sp.是自然界中较为常见的病原菌，进一步深入研究病原菌的生物学特性、病害流行规律、防控技术等很有必要，这对竹柏病害的防控具有重要意义。

4 结论

本研究结果表明，引起竹柏藻斑病、炭疽病、叶尖枯病、叶枯病的病原菌分别为Cephaleuros virescens、Colletotrichum gloeosporioides、Pestalotiopsis longisetula、Alternaria tenuissima。其中，叶尖枯病、叶枯病为竹柏上新发现的病害，有关这2种病害的发生流行规律、侵染循环及其相关防治方法等方面的情况有待进一步研究。

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