李芳芳,潘 容,张 偲,王江涛（中国海洋大学化学化工学院,山东 青岛 266100）

纳米铜粉对中肋骨条藻的毒性效应

李芳芳,潘 容,张 偲,王江涛*（中国海洋大学化学化工学院,山东 青岛 266100）

以中肋骨条藻作为受试藻种,研究铜离子、纳米铜和微米铜对它的毒性效应.结果表明,3种铜试剂在不同程度上都会抑制中肋骨条藻的生长,藻密度和叶绿素的增加值与铜试剂加入量基本呈负相关.在整个实验周期96h内,当Cu2+浓度大于0.1mg/L时会对藻产生很大的抑制作用,而纳米铜浓度大于0.15mg/L会严重影响藻密度和叶绿素,在24h内当微米铜浓度低于2mg/L时会促进藻的生长,在96h时高浓度（＞1mg/L）会抑制其生长.纳米铜对中肋骨条藻的毒性作用一方面是溶出的铜离子,另一方面是纳米粒子本身.

纳米铜；微米铜；Cu2+；中肋骨条藻

研究表明,重金属纳米材料会对生物造成毒性,进而通过食物链对人体产生危害［1］.纳米铜在水环境中检出率较高,而且当藻暴露在几种重金属中时,发现铜的致毒作用最强［2］.

浮游植物是水生态系统中最重要的生产者.由于藻类繁殖速度快,并且可以在细胞水平上直接观察它的中毒症状［3］,所以许多国家已经把藻作为检测污染物的实验生物.中肋骨条藻是我国沿海常见硅藻,是很多经济动物幼体的优质饵料生物［4］.目前,虽然已有不少研究进行了纳米材料对动物的毒性探究,如刘红云［5］的纳米氧化物对斑马鱼胚胎孵化率的研究.但纳米材料对微藻的毒性研究还少见报道,尤其是纳米金属.本实验研究纳米铜对中肋骨条藻的毒性作用,旨在为纳米材料的安全性评价提供参考.

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

仪器：光照培养箱（GXZ型智能光照培养箱）,显微镜（DM4000B型智能显微镜,）,高压灭菌锅（LDZX-50FBS立式压力蒸汽灭菌器）,bbe藻类分析仪（UV2550bbe Moldaenke,）.

试剂：纳米铜粉（纯度＞99.9%,10～30nm）,微米铜粉（纯度＞99.9%,325目）,五水硫酸铜（纯度＞99.0% 分析纯）.

1.2实验材料

中肋骨条藻取自中国海洋大学海洋污染生态化学实验室藻种室.海水取自青岛近岸海域,经0.22μm滤膜过滤后加入锥形瓶中,在120℃高温高压下灭菌20min,室温冷却,加入f/2培养液（不加微量元素）,随后加入藻液放入光照培养箱中培养.培养温度为（20±1）℃,光照采用冷白光源,光照度 4000lux,光暗比为 12h：12h.每天定时取样,显微镜计数待其长到指数生长期进行毒性实验.

1.3实验方法

1.3.1纳米铜、微米铜及 Cu2+对中肋骨条藻的毒性实验 将处于指数生长期的中肋骨条藻分别接种到57个250mL的锥形瓶中,使初始藻密度为4.8×105cell/mL,然后加入分散良好的3种铜试剂.培养周期为96h,每天定时取样,取样后摇晃培养瓶以增加二氧化碳溶解量,并重新随机放置培养瓶,以排除光或温度不同造成的影响.每天在光学显微镜下用血球计数板计数,用bbe藻体分析仪测藻活体的叶绿素荧光.在测定叶绿素之前,需要暗适应 20min.根据预实验的实验结果将本次的实验浓度设置为：纳米铜和 Cu2+为 0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3mg/L,微米铜为0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5mg/L,每个浓度设置3个重复.

1.3.2藻液中Cu2+的测定 将生长到96h的加入不同铜试剂的藻液经0.22μm的滤膜过滤,然后用阶梯扫描溶出伏安法测定游离的铜离子浓度［6］.

1.3.3滤液中Cu2+的测定 将生长到96h的藻液过滤,然后在滤液中加入和实验组相同浓度的Cu2+,测定游离的铜离子浓度.

1.3.4数据分析 采用下式（1）计算每一天生物量的相对抑制率（IR）［7］：

式中：IR为相对抑制率,T为实验组生物量,C为对照组生物量.

实验结果以平均值±标准偏差（Mean±SD）来表示,并用Origin9.0软件绘图.采用SPSS16.0软件对藻密度和叶绿素荧光进行差异性分析.各组间的显著性差异用one-way ANOVA进行分析［8］. P＜0.05作为显著性差异的标准.

2　结果与讨论

2.1不同形态的铜对中肋骨条藻藻密度的影响

图1　不同形态和浓度铜试剂对中肋骨条藻细胞密度的影响Fig.4　Cell density of S. costatum under different form and amounts of copper reagents

由图1可以看出,在整个实验过程中,当Cu2+浓度大于 0.1mg/L时,中肋骨条藻会受到较大程度的抑制（P＜0.05）.当 Cu2+浓度小于 0.05mg/L 时,0～24h内实验组的藻密度和对照组相差不大（P＞0.05）,但在24～96h内实验组的藻密度明显低于对照组,中肋骨条藻受到明显抑制（P＜0.05）（图1a）.同样,当纳米铜浓度大于0.15mg/L时,中肋骨条藻会受到较大程度的抑制（P＜0.05）.当纳米铜浓度小于 0.1mg/L时,中肋骨条藻同样会受到抑制,但此时的抑制程度小于相同浓度的 Cu2+实验组（图1b）.当微米铜浓度小于2mg/L时,在24h内实验组的藻密度大于对照组藻密度,在96h时只有当微米铜浓度大于1mg/L才会和对照组有显著性差异（P＜0.05）,并且这种抑制性明显低于Cu2+和纳米铜（图1c）.

图2　不同形态和浓度铜试剂对中肋骨条藻叶绿素含量的影响Fig.4　Chlorophyll of S. costatum under different form and concentration of copper reagents a：铜离子 b：纳米铜 c：微米铜

2.2不同形态的铜对中肋骨条藻叶绿素荧光的影响

如图2所示,在整个实验过程中中肋骨条藻的叶绿素荧光与藻密度变化的趋势大体一致.整体而言,相同浓度下微米铜对中肋骨条藻的毒性低于 Cu2+和纳米铜,只有当微米铜的浓度大于2mg/L时才会产生比较明显的抑制效应.纳米铜的毒性较大,仅次于Cu2+,当其浓度大于0.15mg/L时就会对藻产生较大的毒性（P＜0.05）.

2.3不同实验组的中肋骨条藻的抑制率及 96h的半效应浓度EC50

如图 3所示,在 96h内当纳米铜浓度为0.05mg/L时,相对抑制率比其它浓度组明显要低,并且和Cu2+浓度为0.05mg/L时的相对抑制率相差不是很大.在 24h之内当微米铜的浓度小于1mg/L时对藻的抑制率是负值, 说明在24h这个浓度的微米铜对藻起到促进作用,这可能是因为此时微米铜溶出的离子浓度较低,有研究表明,铜、锌和锰属于过渡金属,低浓度下,可作为酶的辅助因子促进藻类的光合作用,从而促进其生长［9］.在72～96h内当微米铜浓度大于2mg/L时对藻的抑制率才较大.

3种铜试剂对中肋骨条藻的生长产生一定的抑制作用,并呈现出剂量-效应相关关系.按现有方法［10］将抑制百分数对浓度对数进行一元线性回归,得到不同铜试剂对中肋骨条藻的生长剂量-效应方程和96h EC50值（图4）.由图4可以看出,纳米铜对中肋骨条藻的 EC50值大于微米铜,小于铜离子.这说明纳米铜对中肋骨条藻的抑制作用大于微米铜,而小于铜离子.

2.496h时不同粒径铜的溶出离子浓度

由图 5可以看出,当初始加入的 Cu2+和纳米铜的浓度低于 0.15mg/L时,96h藻液中的游离铜离子浓度较低,这可能是因为一部分铜离子与海水中的腐殖酸［11］、PO43-、OH-形成络合物［2］,从而降低了藻液中铜离子浓度.当两者初始加入的浓度大于 0.15mg/L时,藻液中游离铜离子的量逐渐增加,进而对藻产生较大危害,使藻密度和叶绿素急剧下降.当 96h微米铜的初始浓度低于 2mg/L时,藻液中的铜离子浓度呈降低趋势,这可能是铜离子与腐殖酸和 PO43-形成聚合物.当微米铜的初始浓度高于 2mg/L时,藻液中的铜离子浓度呈明显增加趋势.初始浓度相同的纳米铜和微米铜在藻液中溶出的铜离子浓度不同.

图3　不同形态和浓度铜试剂对中肋骨条藻的相对抑制率Fig.4　The relative inhibition rates of S. costatum under different form and concentration of copper reagents

图4　不同形态铜试剂对中肋骨条藻生长的抑制效应（96h）Fig.4　The inhibition effects of different copper form and concentration on the growth of S. costatum （96h）

2.5藻细胞内总铜离子与测定铜离子的比较

根据已有的方法［12］对 ［M］/（［M］t-［M］）与［M］作图,计算滤液中游离的铜离子.表 1为滤液中Cu2+的计算值与测定值的比较,结果表明测定值与理论计算值相差不大,只有当初始浓度为0.05mg/L时,会有较大差距,这可能是因为此时浓度太低,以至于低于仪器的检出限.

图5　不同形态和浓度铜试剂实验组96h后游离铜离子的浓度变化Fig.4　Variations of the concentration of free copper ions in different copper reagents after 96h

根据滤液中的游离铜离子浓度可以得出海水中的铜络合容量为 0.189mg/L,这与之前研究的海洋中铜的络合容量为1.6×10-7～6.7×10-7mol/L很接近［13］.由滤液中的络合量与Cu2+实验组中的总浓度与游离离子浓度差可以得出进入藻细胞中的铜浓度.用铜离子实验组的相对抑制率对每个细胞内的铜离子作图（图6）,用它作为标准来计算其余2个实验组中每个细胞内的铜离子,由此得出被细胞吸收的总铜量.由表2可知,当初始加入的Cu2+浓度低于0.1mg/L时,Cu2+不会进入藻细胞,当浓度大于0.1mg/L时,Cu2+会进入藻细胞内,对中肋骨条藻产生毒性.由表3可知,当纳米铜的浓度大于0.15mg/L 时,铜离子会进入藻细胞,而即使微米铜的浓度达到3mg/L,溶出的铜离子也不会进入藻细胞.没有进入到藻细胞的铜离子可能会对细胞的形态造成影响,还有可能会影响藻的光合作用,从而抑制藻的生长.总体来说,纳米铜实验组中细胞内的铜离子浓度大于微米铜实验组,与Cu2+实验组相当.纳米铜对细胞的毒害作用大于微米铜,并且与Cu2+相差不大,这说明纳米铜对藻的毒性作用主要是溶出的铜离子,其次还有可能与纳米粒子本身特殊的物理性质有关.

图6　铜离子实验组中相对抑制率与单个细胞中的铜离子含量关系Fig.4　The relationship between relative inhibition rate and the content of copper ion in single cell

表1　滤液中Cu2+含量的理论计算值与测定值的比较Table 1　Comparison of the theoretical calculated value and the measured value of Cu2+content in filtrate

表2　Cu2+实验组中藻细胞内总铜离子与理论计算铜离子浓度的比较Table 1　Concentration comparison of the total value of Cu2+inside of algal cell and the theoretical value of Cu2+in the experimental groups of Cu2+

表3　纳米铜与微米铜实验组中藻细胞内总铜离子与测定铜离子的比较Table 1　Concentration comparison of the total value of Cu2+inside of algal cell and the measured value of Cu2+in the experimental groups of nano-copper and micro-copper

2.6讨论

由 Cu2+,纳米铜和微米铜对中肋骨条藻的实验结果来看,Cu2+和纳米铜在较低浓度就会对藻产生毒性,而微米铜只有在浓度较大时才会有毒性,在浓度较低时还会促进藻的生长.在96h时当微米铜大于2mg/L时,藻细胞会变小,而纳米铜和微米铜在24h就会出现藻细胞变小的情况.由图1和图2可以看出,纳米铜与Cu2+对藻的毒性大体趋势一致,这说明纳米铜对藻的毒害作用主要是溶出的 Cu2+.苑志华等［14］的研究表明,纳米银会在溶液中溶出 Ag+,进而会引起小球藻细胞内的器官损伤,抑制小球藻的生长.相同浓度的纳米铜和微米铜,纳米铜对藻的毒害作用大,这说明了粒子的大小会对藻的生长产生影响.李建宏等［15］认为当铜离子浓度达到0.64mg/L时,几乎能完全抑制蓝藻的生长,Cu2+对光合作用过程的抑制是阻止藻细胞生长的重要原因.闫海等［9］表明铜离子对月形藻的96h EC50为199.5μg/L,毒性作用显著,这种毒性作用主要是金属离子与藻类具有亲和性,亲和性越大越易抑制其生长.本研究中得出铜离子对中肋骨条藻96h EC50为0.07mg/L,这种毒性作用极其显著.而且,有研究得出椭圆小球藻对纳米铜粉的耐受力相对斜生栅藻、四列藻而言最弱,1.3mg/L的纳米铜粉就可以完全抑制椭圆小球藻的生长,造成这一现象的原因很有可能与藻的种类有关［16］.有研究表明纳米铜对微藻的毒性很可能是由于其颗粒小,比表面积大,容易进入细胞内部使细胞坏死［17］,颗粒越小,纳米粒子的尺寸效应和表面效应就越明显,本研究中的纳米粒子的平均粒径为 20nm,具有很强的尺寸效应和表面效应,所以其对中肋骨条藻的毒性比较显著.综合起来主要原因还是纳米铜粉特殊的量子尺寸效应和表面效应.

纳米铜对生物的毒性大于纳米铝和纳米钛,和纳米锌相差不大［18］.有研究表明纳米粒子对藻的毒性作用很可能是诱导细胞产生氧自由基,导致细胞内局部氧化还原失衡,产生大量的细胞毒性从而抑制了藻的生长［19］.超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内重要的可以清除活性氧的抗氧化酶之一,它能够保护生物系统的结构和功能.Sabatini［20］认为栅藻体内的 SOD会随着外加Cu2+浓度增加而增加.尹海川［21］利用改性纳米TiO2对蓝藻的实验发现,纳米TiO2会导致蓝藻的超氧自由基增多,致使叶绿素、光合作用都降低.雷静静等［22］发现,nNiO会使四尾栅藻、普通小球藻和羊角月牙藻的抗氧化能力降低,最终抑制这3种藻的生长.

目前,纳米材料可通过多种途径进入到海洋中,对水生生物造成极大的危害.本实验结果表明,纳米铜粉对中肋骨条藻的毒性主要是溶出的铜离子,其次,粒子的大小对藻的生长也起到一定的作用.之前的研究主要集中在纳米粒子溶出的金属离子,而本实验进一步推测纳米本身也有作用,并且验证了这一推测.傅凤认为 1.3mg/L的纳米铜粉就可以使椭圆小球藻大量死亡［16］,并且当其浓度大于0.3mg/L就会对3种绿藻产生抑制,本实验的结果是浓度大于0.15mg/L的纳米铜粉就能很大程度的抑制中肋骨条藻的生长,这可能是因为不同的藻对外界刺激的耐受性不同.

3　结论

3.1Cu2+,纳米铜和微米铜在一定的浓度范围内会降低中肋骨条藻的藻密度和叶绿素含量,从而对中肋骨条藻的生长均有一定的抑制作用.在整个实验过程中,总体呈剂量效应.

3.23种铜试剂对中肋骨条藻 96h的 EC50为：Cu2+＜纳米铜＜微米铜,所以在实验浓度范围内3种铜试剂的毒性大小为Cu2+＞纳米铜＞微米铜.

3.3初始浓度相同的纳米铜和微米铜96h时溶出的离子浓度不同,并且纳米铜的溶出度大于微米铜.

3.4纳米铜实验组中细胞内的铜离子浓度大于微米铜实验组,与Cu2+实验组相当.

3.5纳米铜对细胞的毒害作用大于微米铜,并且与Cu2+相差不大,这说明纳米铜对藻的毒性作用主要是溶出的铜离子,其次还有可能与纳米粒子本身特殊的物理性质有关.

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致谢：本实验的藻种来源于中国海洋大学海洋污染生态化学实验室,在此表示感谢.

Inhibition effects of copper nanoparticles on the growth of Skeletonema costatum.

LI Fang-fang, PAN Rong, ZHANG Cai, WANG Jiang-tao*（College of Chemistry and Chemical Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China）.

China Environmental Science, 2015,35（9）：2874～2880

By using Skeletonema costatum as experimental algae, the toxic effect of Cu2+, nanometer-copper, and micrometer-copper on it was studied. The results showed that the three copper reagents could inhibited the growth of S. costatum in different degrees. Generally, the increase value of chlorophyll and algal cell density had negative relationship with addition of the copper reagents. In the whole experimental period （96hours）, the growth of S. costatum was strongly inhibited if the concentration of Cu2+was higher than 0.1mg/L, and the algal density and chlorophyll were seriously affected as the concentration of nano-copper was higher than 0.15mg/L. Micro-copper stimulated the growth of S. costatum within 24h when its concentration was lower than 2mg/L. Algae growth was inhibited within 96h in high concentration of micro-copper （＞1mg/L）. The mechanism of the toxic effect of copper nanoparticles on Skeletonema costatum was attributed to its dissolved copper ions and the nanoparticles itself.

nanometer-copper；micrometer-copper；Cu2+；Skeletonema costatum

X503.225

A

1000-6923（2015）09-2874-07

2015-02-10

全球变化与海气相互作用专项（GASI-03-01-02-01）

*责任作者, 教授, jtwang@ouc.edu.cn

李芳芳（1989-）,女,山东德州人,中国海洋大学硕士研究生,主要研究方向为环境分析.