古 励,郭显强,丁昌龙,何 强,单志俊（.重庆大学,三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆400045；.中国海诚工程科技股份有限公司,上海 0003）

藻源型溶解性有机氮的产生及不同时期藻类有机物的特性

古 励1*,郭显强1,丁昌龙1,何 强1,单志俊2（1.重庆大学,三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆400045；2.中国海诚工程科技股份有限公司,上海 200031）

研究了铜绿微囊藻藻细胞全生命周期中氮的转化过程以及藻类有机物的性质,结果表明：溶解性有机氮（DON）在藻类生长周期中总体呈现上升趋势,藻细胞在其生长初期释放量小于 0.05mgDON/107cells,衰亡期释放能力约为 0.40mgDON/107cells；胞外有机物（EOM）中分子量分布在对数期和衰亡期以＜1kDa和＞100kDa为主,稳定期以＜30kDa为主；胞内有机物（IOM）的分子量分布随藻的生长变化较小,集中在＜1kDa和＞100kDa范围内.三维荧光光谱分析表明,EOM中荧光物质主要为类腐植酸和溶解性微生物代谢产物；而IOM主要由类芳香蛋白和溶解性微生物代谢产物组成.

铜绿微囊藻；氮转化；溶解性有机氮

水体富营养化会导致藻细胞的大量繁殖,爆发藻华事件.藻的大量繁殖会释放大量的代谢产物,对水处理过程造成干扰,如影响混凝效果［1-3］,加速膜污染［4］,生成消毒副产物［5-6］等,且干扰程度受藻类代谢产物的性质影响.藻类有机物（AOM）由胞外有机物（EOM）和胞内有机物（IOM）组成.EOM由藻细胞生长代谢释放形成,IOM多源自藻细胞破裂释放出来的内含物.通常认为藻类有机物包含低聚糖类物质、多糖、蛋白质、多肽、氨基酸以及少量的有机酸,其中蛋白质、多肽、氨酸均为典型的有机氮类物质（DON）［1,5-8］.

DON是水中含氮有机物的总称,是水中溶解性有机物（DOM）的重要组成部分,是含氮消毒副产物的重要前体物［9-10］.在氯（胺）消毒过程中,DON中的某些组分可以与消毒剂发生反应生成比含碳消毒副产物（C-DBPs）毒性更高的含氮消毒副产物（N-DBPs）,如卤乙酰胺（HAcAms）、卤代硝基甲烷（HNMs）、卤乙腈（HANs）等［11-12］.有研究表明［13-14］,含氮消毒副产物的生成特性不仅与DON的浓度水平有关,其理化性质对其生成特性也有很重要的影响.

藻类有机物因其藻所处生长周期、环境及藻种类差异呈现出不同的性质［2,8,15］,在研究藻源型消毒副产物时,学者多以对数期或者稳定期的藻类为对象,分析该阶段藻类有机物性质及消毒副产物的生成特性,缺乏对不同生长周期藻的藻类有机物性质的系统分析.而水处理过程中消毒副产物的生成量与藻类有机物的性质密切相关.基于此,本文选择铜绿微囊藻为典型代表,研究藻类全生命周期中的氮的转化过程以及DON的产生及变化规律,对不同生长阶段藻的AOM的性质进行分析比较,以期为藻华爆发水体中氮元素的转化规律,以及高藻水处理过程中含氮消毒副产物前体物的控制提供参考.

1　材料与方法

1.1藻的培养

铜 绿 微 囊 藻 （Microcystis aeruginosa, FACHB-905）购自中国科学院水生生物研究所.采用序批式培养,向装有750mL培养基的1L三角瓶中接种少量处于对数生长期纯藻种,置于恒温光照培养箱中培养,期间不再补充培养液,培养基采用BG-11培养基.恒温培养箱中光照强度为1500～2000lx,温度为（25±1）℃,光暗比为 12h/12h.藻密度采用血球计数板计数.

1.2藻类有机物的分离

EOM 采用藻类悬浮液离心法,选取藻类悬浊液,离心机（TDL-4A,菲恰尔）4000r/min,离心20min,取上清液过滤,滤出液即为 EOM.向离心管中加入等体积的超纯水,将沉淀于离心管底部的藻重新混合均匀,置于离心机按照 EOM分离步骤清洗3次,确保不含 EOM,然后采用冻融法反复冻融 3次,显微镜下观察藻细胞数目,确保80%以上的藻细胞被破坏释放 IOM,最后用滤膜过滤获取IOM.

1.3测试方法

溶解性有机碳（DOC）采用 TOC测试仪（TOC-VCPH,岛津,日本）测定；UV254采用紫外-可见分光光度计（DR5000,HACH,美国）测定；分别采用紫外分光光度法、N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法以及纳氏试剂分光光度法测试 NO3--N、NO2--N和NH4+-N,采用碱性-过硫酸钾消解分光光度法测定TN［16］,DON的质量浓度采用总氮减去无机氮的差减法获得,其分析误差为TN、NO3--N、NO2--N、NH4+-N的方差总和［16-17］.

采用超滤法进行分子量切割,过滤方式为平行过滤［18-20］,超滤膜的孔径分别为 100,30,10,5, 1K；三维荧光光谱（3DEEM）采用荧光分光光度计（F-7000,Hitachi,日本）,参数设置：激发波波长扫描范围为 200～550nm,发射波波长扫描范围为220～650nm,扫描间隔均为5nm,狭缝宽度为5nm,光电倍增管（PMT）电压为 600V,扫描速度为60000nm/min,响应时间为0.002s.EEM谱图均扣除超纯水空白,运用origin 8.5.1绘制三维荧光光谱谱图.荧光区域积分定量分析前将瑞利散射上方的数据置为零,消除瑞利散射的影响；以超纯水做空白参比,消除拉曼散射影响［21-24］.

2　结果与讨论

2.1藻细胞的生长周期的确定

实验条件下铜绿微囊藻的生长曲线如图1所示,其生长周期可被划分为 4个阶段,即适应期0～5d,对数生长期6～33d,稳定生长期34～131d,衰亡期＞132d.适应期藻类数量没有明显变化；在对数生长期,藻密度急剧增长,此阶段藻生长代谢旺盛；进入稳定期后,藻密度在较长时间内维持在一定浓度水平,持续 90多天,此阶段部分藻细胞增殖-衰败交互生长,藻细胞数目基本稳定,但胞内有机物释放至胞外造成会大量胞外有机物的积累；衰亡期,藻细胞衰败速率加快,增殖速率放缓,藻密度逐渐减小,藻液由暗绿色变为黄绿色,继而变为黄色,最终成为白色.此外,藻液由黄绿色变为淡黄色的过程持续时间仅为几天.

Yang等［15］通过胞外有机物的TOC、藻细胞的TOC以及藻密度3个指标绘制了铜绿微囊藻的生长曲线,确定适应期0～3d,对数生长期4～22d,又是稳定期持续时间长,稳定期与衰亡期的界限没有得出.Pivokonsky等［1］以叶绿素a以及EOM 的 DOC绘制了铜绿微囊藻的生长曲线,通过叶绿素a的监测确定适应期为0～2d,对数生长期为3～6d,稳定生长期为 7～16d,16d便进入衰亡期；EOM中DOC呈现相对一致的趋势,适应期DOC增长缓慢,对数期由于代谢旺盛增速加快,稳定期呈现缓慢的增长,衰亡期 DOC迅速增大.本实验所得铜绿微囊藻生长周期相对较长,与吴剑、方晶云等［25-26］所得生长曲线较为一致,不同学者得出的藻生长曲线存在较大的差异与所用的培养基及接种量的不同等因素直接相关.

图1　铜绿微囊藻生长曲线Fig.4　The growth curve for Microcystis aeruginous cultivated in batch

2.2生长周期中氮的转化

2.2.1无机氮 由图2可以看出,NO3--N在整个生长周期中持续下降,NO2--N和NH4+-N呈现先增加后降低的趋势,这与吴剑等［25］研究结论相似.适应期,并未出现藻的大量增殖对 NO3--N进行消耗；对数生长期,藻细胞迅速增殖值,大量的营养元素被利用,NO3--N浓度几乎呈线性降低；稳定生长期初期,藻细胞仍保持着较高的活性,且藻细胞的体积较之前有所增加,部分营养物质被藻细胞作为能量储存在体内,稳定生长期亦存在藻细胞的衰败,其衰败速率随着藻的生长逐渐增大,初期衰败速率增长缓慢,NO3--N被消耗的速率远大于衰败释放质环境中的速度,NO3--N下降速率依然较大；稳定期中后期,衰败速率与增长速率持平,藻密度呈现稳定状态,NO3--N下降速率减缓；进入衰亡期,初期NO3--N浓度仍有所降低,至末期NO3--N略有上升,可能的原因是：末期藻密度减小,活性降低,光合作用产生的氧气很少,胞内物质随着藻细胞大量衰败释放到水体,DON存在少量分解,从而导致NO3--N略微上升.

图2　铜绿微囊藻EOM中不同氮形态质量浓度变化曲线Fig.4　Transformation for different nitrogen during the growth of Microcystis aeruginous

NO2--N浓度随着藻密度的增加,呈现先增大随后略微降低的趋势,但均在10mg/L以内,相对于NO3--N变化微弱.关于NO2--N的变化趋势,可能存在以下两方面原因：（1）NO3--N被藻细胞吸收过程中首先被硝酸还原酶还原成亚硝酸盐,然后通过亚硝酸盐还原酶和谷氨酸合成酶最后合成胞内有机物质,硝酸盐氮和亚硝酸盐氮均可以作为藻的碳源被利用,但当细胞活性降低时,部分亚硝酸盐随藻代谢产物被释放到胞外［27］；（2）铜绿微囊藻在光照条件下光合作用产生氧气,黑暗条件下呼吸作用耗氧造成氧化还原电位较低,可能存在自养反硝化作用,产生中间产物 NO2--N释放至胞外［25］.NH4+-N呈现缓慢的上升趋势,但最高浓度小于10mg/L.藻细胞内及释放至胞外的有机氮可能被藻细胞利用或部分分解,产生了中间产物 NH4+-N,随着有机氮的累积,中间产物NH4+-N浓度也逐渐增加.

2.2.2总氮及有机氮 如图2所示,藻液中的总氮浓度在适应生长期、对数生长期以及稳定生长期与NO3--N的变化趋势一致,但在衰亡期,由于藻细胞的大量衰败致使藻细胞内储存的含氮有机物释放至胞外环境中,使得 TN浓度呈现较明显的上升趋势.对于 DON,适应生长期几乎没有释放；对数生长期细胞代谢旺盛,且少有藻细胞的衰败,因此仅有少量DON的释放；稳定生长期初期 DON的浓度上升速度依然缓慢,进入稳定期中后期 DON浓度上升速度明显加快,可能的原因是：稳定期初期,藻细胞衰败数量较少,随着培养基中营养物质逐渐消耗殆尽,藻细胞死亡数量增加,致使含氮丰富的内含物（如氨基酸、藻青蛋白、脂肪胺等）释放进入环境中,DON浓度迅速增加；衰亡期,藻细胞衰亡速度进一步加快,更多的胞内有机物释放,DON出现累积.

图3　单位藻细胞（107cells）产生的DON随生长周期的变化Fig.4　DON mass concentration per 107cells during the growth period

胞内物质的释放使得EOM中有机物浓度升高,可能会对混凝起到抑制作用,难以去除［1,3］.此外,研究表明 DON的浓度与含氮消毒副产物呈一定正相关［28］,而稳定期中后期以及衰亡期EOM中的DON浓度非常高,最高接近100mg/L,因此当水源水爆发藻华时,应该特别注意对藻EOM 性质进行表征,根据水质情况慎重选择应急处理措施,避免消毒中N-DBPs产率过高引发用水安全风险.

从图 3可看出,处于对数生长期以及稳定生长期的铜绿微囊藻释放 DON的能力小于0.05mg/107cells,进入衰亡期藻细胞释放 DON的能力急剧上升,升至 0.4mg/107cells,尽管这主要是由于藻细胞EOM中DON的积累以及藻密度的逐渐减小所致,但以上数据提供了藻华爆发期间液相 DON浓度的基本参考,可通过藻细胞的数量,初步了解所释放含氮有机物的数量.

2.3不同生长周期的藻类有机物性质表征

2.3.1不同生长周期基本水质参数的变化 从表 1可以看出,AOM在各个时期的特征紫外吸光度值（SUVA值）均较低,为0.87～2.34L/（m∙mg）. SUVA值与物质的芳香度以及疏水性物质的数量呈正相关关系［29］,SUVA值低表明AOM的芳香性较低以及亲水性有机物含量较高.另一方面,SUVA值低还表明藻类有机物中腐植酸和富里酸类物质、高分子质量有机物、不饱和双键及芳香族类有机物含量少,不易被混凝沉淀工艺去除［30］.IOM的SUVA值随着藻细胞生长周期的延长逐渐增大,由0.87增至1.79,最终高达2.34,说明IOM随着藻的生长,其芳香性、疏水性物质逐渐增加；EOM 的 SUVA值为 0.88～1.34L/ （m∙mg）,随生长周期不同变化较小,表明EOM中亲水性物质较多,不易被去除.IOM中DOC/DON质量浓度比可以看出,稳定期的 IOM中含有的有机氮成分最高,而对数期的 IOM中有机氮成分比例最低,衰亡期的 IOM中有机氮可能作为能量物质被藻细胞消耗,致使比例相对较低.可能的原因：对数期营养物质充足,藻细胞增殖速度快,储存的能量物质较少,稳定期出现营养物质的竞争,蛋白质作为蓝藻的重要的储能物质贮存于胞内［1］,表现为有机氮组分的增加,而衰亡期营养物质严重缺乏,胞内能源物质被藻细胞消耗,DON/DOC下降.

表1　不同生长周期的EOM/IOM的基本水质参数Table 1　Characteristics of EOM/IOM extracted from different growth phases

2.3.2不同时期藻类有机物分子量分布特性如图4所示,3个时期IOM分子量分布均为双峰型,主要集中在＜1kDa的和＞100kDa两个范围内.对数生长期、稳定生长期、衰亡期的铜绿微囊藻的IOM的分子量在＜1kDa和＞100kDa的范围内所占的比例分别为16%、25%、44%和76%、61%、54%,表明随着藻细胞的生长,藻细胞内含物中小分子有机物所占的比重在增加,大分子的物质所占的比重减小.IOM中小于1kDa的物质包括叶绿素、藻毒素、嗅味化合物、氨基酸等,大于100kDa的有机物主要包含藻蓝蛋白和碳水化合物等［31］.出现上述情况可能的原因：环境中营养元素逐渐减少,藻细胞之间对营养物质的竞争逐渐增强,使得稳定期储存的部分胞内物质被藻细胞自身降解利用转化为小分子有机物［1］.

相比之下,EOM的分子量分布在对数期和衰亡期大致相同,分子量分布集中在＜1kDa和＞100kDa 2个区域,其中对数期两个分子量区域所占的比例为41%、45%,衰亡期为24%和58%.稳定生长期EOM的分子量分布与对数期和衰亡期存在较大差异,主要集中在＜30kDa的范围内（约占 EOM 的 93%）,其中＜1kDa、1～5kDa、5～10kDa、10～30kDa的EOM所占总EOM的比例分别为24%、26%、31%、12%.实验中所取对数期藻处于对数期后期,因此 EOM分子量分布情况与 Henderson［8］研究的稳定生长期初期的EOM分子量分布较为相似.衰亡期EOM中大分子有机物的增加主要是由细胞死亡裂解后释放出大量大分子胞内有机物造成的.

图4　不同生长周期的藻类有机物分子量分布Fig.4　Transformation of MW fractions of AOM under different growth stages

由图5可以看出,对数期与衰亡期的EOM和IOM的分子量分布相似,稳定期的EOM和IOM分子量分布有较大差异.分析其原因可能是：对数期的藻细胞所处环境营养物质充足,且代谢旺盛,使得藻细胞胞内胞外有机物性质相似；而稳定期有内含物的释放,同时新的藻细胞生长对内含物进行利用和代谢,从而使得大分子细胞降解,形成1～100kDa的中等分子量结构的有机物；衰亡期,藻细胞的衰亡破裂向EOM中释放大量胞内物质,致使衰亡期的IOM和EOM分子量分布相似.

2.3.3不同生长周期藻类有机物三维荧光表征 相比其他表征方法,三维荧光光谱的选择性更强以及灵敏度更高,并且操作简单,被广泛用于有机物性质的表征过程.根据 Chen等［21］的研究,将荧光区域划分为5个区域：区域I和II（芳香蛋白类,λex＜250nm, λem＜380nm）,区域 III（富里酸类,λex＜250nm, λem＞380nm）,区域 IV（溶解性微生物代谢物类,λex＞250nm, λem＜380nm）及区域V（腐殖酸类,λex＞250nm, λem＞380nm）.区域I、II 和IV代表有机氮类物质,区域III和V代表有机碳化合物［26］.

图5　不同生长周期的藻类有机物分子量分布对比Fig.4　Molecular weight （MW） distributions of AOM under different phases

如图6所示,EOM荧光特征峰主要集中在区域 IV和 V,且区域 IV所在的峰强度更大,表明EOM 中含有大量的腐植酸类物质和溶解性微生物代谢产物.溶解性微生物代谢产物（SMPs）由酪氨酸、色氨酸、蛋白类等富含有机氮的物质组成,因此 EOM中有机氮类物质占较大比重,这与 Li等［6］研究一致.区域 IV内的荧光峰位置随着生长周期的延长没有发生偏移,峰强有所增加（表2）,这主要是由微生物代谢产物的累积所造成的.区域V内的荧光峰位置随着生长周期的延长发生了偏移,表明EOM中腐植酸类物质的结构发生了一定的变化.相比之下,藻类IOM随着生长周期的延长,荧光峰有较大的变化.如图6所示,d、e、f分别代表对数期、稳定期和衰亡期的IOM的三维荧光光谱谱图,IOM中荧光物质主要集中在类蛋白物质和溶解性微生物代谢产物两个富含有机氮的区域内,主要包括芳香蛋白类物质、酪氨酸、色氨酸、蛋白类化合物等,表明IOM中的有机物以有机氮类化合物为主,这与王昊等［32］研究结果相似.另外两个比较明显的峰出现在区域III和V,这两个区域代表有机碳类化合物.随着藻生长周期的延长,荧光峰（Ex/Em,275～280/330nm）和（Ex/Em,225/ 330～335nm）峰强逐渐减小,可能的原因是：稳定期和衰亡期的藻细胞,尤其是在衰亡期,由于营养物质减少,藻细胞竞争激烈,致使胞内蛋白类储能物质被消耗分解为腐植酸和富里酸等物质［33］.

为进一步分析不同生长周期 AOM中藻类有机物的荧光物质组成,对不同时期的藻类有机物的荧光光谱进行了荧光区域积分,并且将积分结果转化为单位 DOC时对应的值,降低浓度不同带来的差异,结果见表3.各个区域单位DOC质量浓度下荧光体积占五个荧光区域总体积的百分比（Pi）如图7.可以看出,对数期、衰亡期的IOM中的单位 DOC质量浓度中含有的荧光物质较EOM要多.稳定期的EOM中单位DOC质量浓度中含有的荧光物质比例较IOM中高.从图7可以看出,EOM中荧光物质主要集中在荧光区域为IV和V,对数期、稳定期和衰亡期EOM中区域为IV和V的Pi分别为50%和42%、19%和73%、38%和54%；对数期与稳定期的IOM中含有较大比重的蛋白类（区域I与II）荧光物质,而衰亡期中蛋白类荧光物质Pi减小,与之相对应的是腐植酸类物质（区域 V）的急剧增加.出现上述结果可能的原因：稳定期的藻储存蛋白类物质作为能源物质,因此IOM中富含有机氮的荧光区域（区域 I、II与 IV）所占比重为整个生命周期中最大的；衰亡期作为储能物质的蛋白质被利用分解为富里酸、胡敏酸等有机物,因此出现了有机氮荧光区域所占比例的减小以及类腐殖酸和富里酸这类有机碳物质荧光区域比重的增加.

图6　不同生长周期AOM的EEM谱图Fig.4　Fluorescence EEMs of AOM under different phases

表2　不同样品的EEM特征峰峰强Table 1　Fluorescence spectral parameters of different samples

表3　不同时期AOM的单位DOC质量浓度的区域荧光体积Table 1　Excitation-emission area volumes per DOC mass concentration in specific regions of AOM during different growth phases

图7　不同时期AOM （EOM/IOM）的EEM光谱Pi百分比分布Fig.4　Pi （%） distributions in EEM spectra of AOM （EOM/IOM） under different growth phases

3　结论

3.1微囊藻生长过程中,水体中 TN存在下降,说明藻华爆发过程存在一定脱氮作用.

3.2进入稳定期后期,藻细胞衰亡速率增大,释放大量有机氮内含物,液相中 DON浓度急剧升高；生长初期藻细胞 DON的释放能力小于0.05mg/107cells,衰亡期释放能力约为 0.40mg/ 107cells.

3.3对数期和衰亡期的藻 EOM 分子量呈双峰分布,稳定期的EOM以小分子有机物为主；IOM在整个生长周期中分子量均呈现双峰分布,主要集中在＜1kDa和＞100kDa内,随藻的生长胞内的大分子物质逐渐被分解为小分子物质.

3.4EOM中荧光物质种类在整个生长周期内变化较小,主要为腐植酸类物质和溶解性微生物代谢产物,荧光物质结构略有变化；IOM中荧光物质主要为芳香蛋白类和溶解性微生物代谢产物,稳定期藻的IOM中有机氮类物质所占比重最大.

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Formation of algae-derived DON and characterization of algae organic matter （AOM） from different stages.

GU Li1*, GUO Xian-qiang1, DING Chang-long1, HE Qiang1, SHAN Zhi-jun2（1.Key Laboratory of Eco-Environment of Three Gorges Region of Ministry of Education, Chongqing University, Chongqing 400045, China；2.China Haisum Engineering Co. Ltd., Shanghai 200031, China）.

China Environmental Science, 2015,35（9）：2745～2753

Formation rules of dissolved organic nitrogen （DON）, as well as characteristics of extracellular oganic matter （EOM） & intracellular organic matter （IOM） during the growth of Microcystis aeruginous have been studied. The results show as follows： DON concentration of EOM shows a growing tendency during the growth of Microcystis aeruginous, the yield of which is less than 0.05mg DON per 107cells in the early growth phase, around 0.40mg DON per 107cells in the late growth phase, respectively； molecular weight distributions of EOM during exponential phase and decline phase mainly concentrate in range of less than 1kDa and more than 100kDa, while organic matter less than 30kDa dominating EOM in stationary phase；molecular weight distributions of IOM concentrate in range of more than 1kDa and less than 100kDa in the three phases. The main fluorescence regions of EOM occur at the fluorescence region of humic acid-like materials and soluble microbial products. By contrast, the region of aromatic proteins and soluble microbial products dominate the main region of EEM spectra of IOM.

Microcystis aeruginous；transformation of nitrogen forms；dissolved organic nitrogen （DON）

X524

A

1000-6923（2015）09-2745-09

2015-01-22

国家自然科学基金青年基金项目（51208531）

*责任作者, 副教授, guli@cqu.edu.cn

古 励（1982-）,男,副教授,研究方向为安全饮用水水质保障理论与技术,城市固废处理处置及资源化技术研究.发表论文20余篇.