血栓通及单体成分人参皂苷Rd对内毒素激活小胶质细胞的影响*

2015-08-29杨红云刘晓雷柴丽娟王少峡胡利民

天津中医药大学学报 2015年6期

杨红云，刘晓雷，柴丽娟，王少峡，胡利民

杨红云，刘晓雷，柴丽娟，王少峡，胡利民

（天津中医药大学中医药研究院，天津市中药药理学重点实验室，教育部方剂学重点实验室，天津300193）

［目的］研究血栓通及其单体成分对小胶质细胞（BV-2）的影响及其作用机制。［方法］实验分为对照组、脂多糖刺激组、加药组和阳性药米诺环素组，CCK-8检测血栓通（不同稀释倍数的血栓通及其单体成分）对小胶质细胞活力的影响；Greiss法检测脂多糖（LPS）诱导小胶质细胞一氧化氮（NO）产生的影响，实时定量聚合酶链反应（PCR）检测炎性基因的表达。［结果］血栓通在0.5～50 mg/L范围内对LPS诱导的小胶质细胞NO的产生没有抑制作用；在血栓通5种单体成分中，人参皂苷Rg1、Rb1、Re、三七皂苷对小胶质细胞NO的产生没有抑制作用；人参皂苷Rd在不影响细胞活力的情况下能明显抑制NO产生，并且能抑制炎症基因诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）mRNA的表达。［结论］血栓通单体成分人参皂苷Rd抑制激活的小胶质细胞产生NO和iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA的表达可能是血栓通发挥神经保护作用的物质基础。

血栓通；一氧化氮；炎性介质；小胶质细胞

小胶质细胞是一种神经胶质细胞，是中枢神经系统的第一道，更是最主要的免疫防线，主要功能是清除中枢神经系统中损坏的神经、斑块及感染性物质。因此脑缺血、神经退行性疾病、感染等引起的许多微环境因子变化可迅速使小胶质细胞活化。活化的小胶质细胞能显著上调许多细胞因子的分泌水平，能够通过产生抗炎作用而促进神经元的存活；而大部分为一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素等细胞毒性物质能直接损伤神经元或引起其他继发性损伤。诱导型一氧化氮合酶（iNOS）是合成NO的重要酶类，iNOS对学习记忆的影响是通过NO的作用来实现的［1］。NO是内源性血管舒张因子的主要活性成分［2］，能引起血管扩张，增加血流量，参与机体生理调节，具有促细胞凋亡和抗细胞凋亡的双重特性，其促凋亡和抗凋亡的作用很大程度上依赖于量的多少和及其发挥作用的细胞类型［3］。现阶段治疗和缓解神经退行性疾病和脑损伤的重要手段，是抑制活化的小胶质细胞所引发的炎症反应［4-5］。中风后通过减弱血脑屏障的通透性和减少神经细胞凋亡抑制小胶质细胞活性而达到保护脑组织的目的［6］。因此调节小胶质细胞炎症反应作为神经保护的方案略受到越来越多的关注。

血栓通的主要成分为三七总皂苷，三七总皂苷具有耐缺氧、改善微循环、增加机体免疫力、抗炎、抗衰老等多方面的生理活性［7］，特别是它具有较强的抗氧化作用，直接清除氧自由基的作用［8］，并且能减轻脑水肿，改善血脑屏障通透性［9］。因此在很多领域都得到了广泛应用，主要应用在心脑血管系统疾病和中枢神经系统疾病［10］，对脑血管继发性损伤有保护作用，能有效抑制神经细胞凋亡有抑制作用［11］，但其作用机制尚不明确。本实验采用脂多糖（LPS）激活小胶质细胞，考察注射用血栓通抗神经炎症的作用及机制。

1　材料与方法

1.1材料与试剂小胶质细胞株BV-2（北京协和医学院），注射用血栓通（吉林敖东股份有限公司），血栓通单体成分人参皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd及三七皂苷（中新药业）。胰蛋白酶、DMEM培养基、胎牛血清（Gibco，美国）；T25细胞培养瓶，96孔、48孔、12孔细胞培养板（Corning），NO检测试剂盒（碧云天），Cell Counting Kit-8（CCK-8，北京同仁化学）；LPS（碧云天），二氧化碳（CO2）恒温培养箱（THERMO，FORMA3111型，美国），倒置相差显微镜（Nikon，TE200，日本），低温高速离心机（BECKMAN，64R型，美国），实时定量PCR仪（ABI，7500型，美国），DU-800紫外分光光度计（DNA/Protein Analyzer，BECKMAN，美国），PCR1000（BIO RAD，日本），Trizol（invitrogen）。

1.2BV-2小鼠小胶质细胞株的培养37℃水浴复苏细胞，接种于corning T25培养瓶中，放于孵箱中培养［5%CO2、95%氮气（N2）、37℃饱和湿度］，待细胞融合后用胰蛋白酶消化种板。

1.3血栓通及单体对小胶质细胞活力的影响待细胞汇合后胰酶消化，调整细胞浓度至4×105个/mL，接种于96孔板，每孔加液量为0.1 mL，培养过夜，将细胞完全培养液替换为含有血栓通（终浓度分别为50 mg/L）及其单体成分的（10 μmol/L）基础培养液孵育24 h，弃去上清，加入用基础培养基配制的CCK-8（终浓度V/V1∶10）继续孵育0.5h后于450 nm处读取吸光度值。

1.4血栓通及其单体对小胶质细胞NO产生的影响待细胞汇合后胰酶消化，调整细胞的浓度为4×105个/mL，接种到48孔板，每孔加液量为0.4 mL，培养过夜，将细胞完全培养液替换为含有不同浓度的血栓通（终浓度分别为50、5、0.5 mg/L）和血栓通单体成分（终浓度10 μmol/L）的基础培养液预孵0.5 h，后加入LPS（终浓度0.1 mg/L）刺激，继续培养24h后吸取50μL细胞上清，Greiss法检测NO浓度。

1.5人参皂苷Rd对小胶质细胞iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA表达的影响待细胞汇合后胰酶消化，调整细胞浓度至4×105个/mL，接种到12孔板，每孔加液量为2.5 mL，培养过夜，将细胞完全培养液替换为含有血栓通单体成分（终浓度10 μmol/L）的基础培养基预孵0.5h，然后加入LPS（0.1mg/L）刺激，37℃孵育8 h后提取总核糖核酸（RNA）。用DU800检测RNA浓度及A260/A2801.5μgRNA反转录为cDNA（20μL体系）。取1μL的cDNA产物作为模板加入炎症基因引物进行扩增，看家基因GAPDH作为内参。数据采用2-△△CT相对定量法分析。

1.6统计学方法采用SPSS18.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差表示，组间差异性比较采用单因素方差分析，组间两两比较，若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2．1CCK-8检测血栓通对小胶质细胞活力的影响与对照组相比，阳性药米诺环素组、血栓通组（50 mg/L）细胞活力没有统计学差异，表明米诺环素、血栓通（50 mg/L）均没有细胞毒作用。见表1。

表1　血栓通对小胶质细胞活力的影响

注：结果重复3次，趋势一致。

组别对照组血栓通组米诺环素组n 6 6 6 1.261 0±0.077 2 50 mg/L00　1.361 2±0.041 2 10 μmol/L　1.381 6±0.101 5浓度　吸光度-

2.2Greiss法检测血栓通对小胶质细胞分泌NO的影响与对照组相比，LPS组能显著增加NO的释放，与LPS组相比，阳性对照组米诺环素能明显抑制NO的释放，血栓通（0.5～50 mg/L）不能抑制NO的释放。见表2。

表2　血栓通对小胶质细胞NO的影响

注：与对照组比较，**P＜0.01；与LPS组比较，##P＜0.01。结果重复3次，趋势一致。

组别对照组LPS组血栓通组米诺环素组n 6 6 6　6浓度　NO浓度（μmol/L）-0-1.326 8±0.241 3 00.1 mg/L　015.919 3±1.090 1** 50.0 mg/L　013.062 1±1.154 9 05.0 mg/L　014.184 6±1.701 1 00.5 mg/L　015.142 2±0.536 5 0010.0 μmol/L　005.387 3±0.444 5##

2.3CCK-8检测血栓通单体对小胶质细胞活力的影响与对照组相比，人参皂苷Rd、Rg1、Rb1、Re，三七皂苷组细胞活力均没有统计学差异，表明这5种单体成分无细胞毒作用。见表3。

表3　血栓通单体成分对小胶质细胞活力的影响

注：结果重复3次，趋势一致。

组别对照组人参皂苷Rd人参皂苷Rg1人参皂苷Rb1人参皂苷Re三七皂苷组n 6 6 6 6 6 6浓度（μmol/L）　吸光度-1.167±0.057 1 10　1.219±0.066 3 10　1.222±0.078 8 10　1.187±0.057 8 10　1.193±0.055 9 10　1.137±0.062 7

2.4Greiss法检测血栓通单体成分对小胶质细胞分泌NO的影响与对照组相比，LPS组能显著增加NO的释放。与LPS组相比，人参皂苷Rd在无细胞毒的情况下能明显抑制NO的释放，人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、三七皂苷对NO无明显抑制作用。见表4。

表4　血栓通单体成分对小胶质细胞分泌NO的影响μmol/L

注：与对照组比较，**P＜0.01；与LPS组比较，##P＜0.01。结果重复3次，趋势一致。

组别对照组LPS组人参皂苷Rd n 6 6 6 6 6 6 6 -1.071 9±0.223 6 00.0.1　12.513 1±1.543 0** 10　8.656 9±1.464 4##浓度　NO浓度-人参皂苷Rg1人参皂苷Rb1 10　12.464 1±0.439 1 10　10.705 9±0.458 9人参皂苷Re三七皂苷10　11.990 2±0.539 4 10　12.977 1±2.324 8

2.5人参皂苷Rd对小胶质细胞iNOS、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）mRNA表达的影响与对照组相比，LPS组能明显提高iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA的表达；与LPS组比较，人参皂苷Rd能显著抑制iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA的表达。见表5。

表5　人参皂苷Rd对小胶质细胞iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA表达的影响μmol/L

注：与对照组比较，**P＜0.01；与LPS组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。结果重复3次，趋势一致。

组别　iNOS　IL-1β　IL-6对照组　1.048±0.403　1 711.006±290.135　1.049±000.415 LPS组　32.451±2.366**1 718.022±294.243**6 465.623±837.678**人参皂苷Rd　11.293±0.390##1 241.609±302.286#1 118.268±115.271##n 6 6 6浓度-0.1 mg/L 10 μmol/L

3　讨论

血栓通0.5～50 mg/L范围内对LPS诱导的小胶质细胞NO的产生没有抑制作用，在血栓通5种单体成分中，人参皂苷Rd可以在不影响细胞活力的情况下抑制NO产生，同时能显著抑制iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA等炎症基因的表达。

小胶质细胞是中枢神经系统的巨噬细胞，具有免疫防御和炎症反应［12］。活化的小胶质细胞可合成和分泌一系列细胞因子、蛋白质或其他生物活性分子，这些物质中某些发挥神经保护作用，某些可产生神经毒性作用，进而导致神经元死亡［13-14］。

小胶质细胞受到刺激后迅速激活，其形态功能发生明显改变。抑制小胶质细胞活化可以减轻脑内继发性损伤，同时使受损的组织和细胞得到修复。研究表明，血栓通单体成分人参皂苷Rd在不影响细胞活力的前提下，能明显抑制小胶质细胞活化释放NO、抑制多数炎症基因mRNA的表达。因此，血栓通可能是通过抑制小胶质细胞活化减少炎症介质的释放来发挥其神经保护作用的机制之一。

［1］王秀云，李积胜，朱虹，等.不同剂量补锌对大鼠学习记忆功能及海马一氧化氮合酶活性的影响［J］.天津中医药，2006，23（1）:54-56.

［2］吕炳强，姜希娟，赵桂峰，等.救心胶囊对损伤内皮细胞NO和ET-1释放的影响［J］.天津中医药，2004，21（4）：322-324.

［3］康健，刘桠，谢春光，等.参芪复方对GK大鼠心肌细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax及NO的影响［J］.天津中医药，2009，26（6）：489-492.

［4］Giovannini MG，Scali C，Prosperi C，et al.Beta-amyloidinduced inflammation and cholinergic hypofunction in the rat brain in vivo:involvement of the p38MAPK pathway［J］. Neurobiology of disease，2002，11（2）:257-274.

［5］van Rossum D，Hanisch UK.Microglia［J］.Metabolic Brain Disease，2004，19（3-4）:393-411.

［6］Jin R，Yu SY，Song ZF，et al.Phosphoinositide 3-kinasegamma expression is upregulated in brain microglia and contributes to ischemia-induced microglial activation in acute experimental stroke［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2010，399（3）:458-464.

［7］陈英.三七总皂苷的药理研究及临床应用进展［J］.广西医学，1998，20（6）:1109-1112.

［8］雷秀玲，董雪峰，陈植和，等.络泰对大鼠实验性急性心肌缺血的保护作用及抗脂质过氧化作用［J］.天然产物研究与开发，2001，13（4）:58-61.

［9］Liu JH.Effect of PNS on brain blood flowing and brainblood barrier with cerebral ischem ial［J］.Apoplexy and Nervous disease，2002，19（3）:164-165.

［10］张剑峰，张丹参.三七总皂苷药理作用研究进展［J］.医学综述，2007，13（6）:472-474.

［11］胡志洁，张志耘.三七总皂苷对心脑血管的药理作用研究［J］.天津药学，2006，18（6）:51-55.

［12］Li J，Zhang SY，Lu MR.Hydroxysafflor yellow A suppresses inflammatoryresponses of BV2 microglia after oxygenglucose deprivation［J］.Neuroscience Letters，2013，535：51-56.

［13］景浩然，柴丽娟，郭虹，等.大黄酸对内毒素激活小胶质细胞的影响［J］.天津中医药大学学报，2012，31（1）:34-35.

［14］Ladecola C，Anrather J.The immunology of stroke:from mechanisms to translation［J］.Nature Medcine，2011，17（7）: 796.

Effect of Xueshuantong and Ginsenoside Rd on lipopolysaccharides actived microglia cells

YANG Hong-yun，LIU Xiao-lei，CHAI Li-juan，WANG Shao-xia，HU Li-min
（Key Laboratory of Pharmacology of Traditional Chinese Medical Formulae，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Chinese medicine Pharmacology，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To study the effects of Xueshuantong and its monomer on actived microglia（BV-2）and its mechanism.［Methods］The experiment was divided into control group，lipopolysaccharide（LPS）group，dosing group and positive control group（mino），detecting of Xueshuantong（different dilution multiples of Xueshuantong and its monomer composition）to the vitality of microglia and nitric oxide（NO）induced by LPS using the Greiss method.［Results］Between 0.5～50 μg/mL，Xueshuantong could not inhibit the microglia release NO induced by LPS，among the 5 kinds of monomer composition of Xueshuantong，ginsenoside Rg1，Rb1，Re and Notoginsenoside could not inhibit the microglia release NO induced by LPS，however，ginsenoside Rd could inhibit NO secretion without affecting the cell vitality，and inhibit the mRNA expression of iNOS，IL-1β，IL-6.［Conclusion］The monomer composition of ginsenoside Rd in Xueshuangtong can inhibit activated microglia release NO and the mRNA of iNOS，IL-1β，IL-6 significantly.It may be one of neural protection mechanism.

Xueshuantong；nitric oxide；inflammatory mediator；microglia

R285.5

1673-9043（2015）06-0342-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.12.07

国家重大新药创制项目资助（2012ZX09101201-004）。

杨红云（1987-），女，硕士研究生，主要从事神经药理学研究。

王少峡，E-mail:wangshaoxia1978@hotmail.com。

（2015-07-13）