刘秀娜，张　艳，礼　海（.辽宁中医药大学，沈阳00；.辽宁中医药大学附属医院，沈阳00；.沈阳市第二中医医院，沈阳00）

·实验研究·

益气活血复方对心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠心肌能量代谢的影响*

刘秀娜1，张艳2，礼海3
（1.辽宁中医药大学，沈阳110032；2.辽宁中医药大学附属医院，沈阳110032；3.沈阳市第二中医医院，沈阳110101）

［目的］观察益气活血复方对心肌梗死后慢性心力衰竭（CHF）大鼠心肌能量代谢的影响。［方法］选用SPF级健康雄性SD大鼠80只，随机选取20只为空白对照组，其余60只大鼠采用左冠状动脉前降支结扎法配合力竭式游泳及节食方法复制慢性心力衰竭大鼠模型。将造模成功的大鼠随机分为中药组、西药组及模型组。空白对照组与模型组给予常规等容积蒸馏水灌胃，每日1次，中药组按生药9.2 g/（kg·d）剂量给予益气活血复方灌胃，每日1次，西药组按生药1.5 mg/（kg·d）剂量给予赖诺普利灌胃，每日1次。持续给药28 d后，禁食不禁水12 h，取心肌组织及血浆。酶联免疫吸附法（ELISA）检测B型脑尿钠肽（BNP）浓度，比色法检测三磷酸腺苷（ATP）浓度；实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）和免疫蛋白印迹法检测过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α（PGC-1α）基因和蛋白的表达。［结果］与空白对照组比较，模型组、中药组、西药组PGC-1α mRNA、蛋白表达及ATP浓度降低，BNP浓度升高，组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，中药组和西药组PGC-1α mRNA、蛋白表达及ATP浓度升高，BNP浓度降低，组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。中药组与西药组PGC-1α mRNA、蛋白表达及ATP浓度、BNP浓度无明显差异，组间差异无统计学意义（P＞0.05）。［结论］益气活血复方可通过激活与心肌能量代谢有关的PGC-1α因子，增加线粒体的产能，以此来改善和纠正心力衰竭。

益气活血复方；慢性心力衰竭；PGC-1α；三磷酸腺苷；B型脑尿钠肽

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2015.01.07

现研究认为，能量代谢障碍是贯穿于心脏从代偿性肥大到衰竭的重要因素之一。过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1（PGC-1），是一种通用核受体辅助激活因子，主要在能量代谢中起作用。过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α（PGC-1α）是PGC-1的主要成员之一，被认为是线粒体生物发生的主导协调因子，在线粒体增长中发挥了作用［1］。益气活血复方是吾师张艳在临床从医30余年总结出来的经验方药之一，在临床治疗慢性心力衰竭（CHF）上具有较好的疗效。由此，本研究通过观察对益气活血复方对CHF大鼠心肌能量代谢的影响，为中医药治疗CHF提供科学依据。

1　材料及方法

1.1实验动物SPF级12周健康SD大鼠80只，雄性，体质量为（250±10）g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK（辽）2010-0001。

1.2药物、试剂与仪器益气活血复方（由黄芪、太子参、红花、丹参、益母草、茯苓、葶苈子组成），由辽宁中医药大学附属医院药剂科提供和制备，处方中全部药材均符合《中华人民共和国药典》2005年版相关规定，含生药0.4 g/mL。赖诺普利片，由上海信谊万象药业股份有限公司生产，每片10 mg，批号：HI0960265。DNA maker、PGC-1α PCR试剂盒购自于北京全式金生物技术有限公司。Trizol，购自Invitrogen公司。B型脑尿钠肽（BNP）试剂盒购自武汉优尔生科技股份有限公司。三磷酸腺苷（ATP）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。HX-300小动物呼吸机，由成都泰盟科技有限公司生产。SONO S5500彩色多普勒超声机，由Agilnet公司生产，实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪7500型，由美国Agilnet公司生产。

1.3心力衰竭大鼠造模随机选取20只未予任何处理的正常大鼠为空白对照组（以下简称空白组）。其余60只正常大鼠参照参考文献［2］制备CHF大鼠模型。适应性喂养1周后，10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉大鼠，将麻醉后大鼠取仰卧位于实验台固定好，行经喉气管插管术连接小动物呼吸机（频率为每分钟80次，潮气量为0.8 mL）。于大鼠左胸被皮，经碘伏消毒后在其左侧第3、4肋间横向剪开皮肤，按照肌肉的走行方向进行逐层钝性分离软组织至肋间肌层，再沿第3肋间打开胸腔，按照心脏的解剖特征在左心耳和肺动脉圆锥之间找到左冠状动脉前降支，于其起点下2～4 mm处用医用美容线结扎至周围心肌变白为度，将心脏重置于胸腔，处理好胸腔内瘀血、棉球、线头等外源性污物，用3号线快速逐层缝合第3肋间、肌层及皮肤，待动物呼吸状态平稳后停小动物呼吸机，断开经喉气管插管针与小动物呼吸机连接处，恢复胸腔负压，待动物能够自主呼吸后，拔出气管插管针。在大鼠四肢插入电针，连接至心电图机，心电图显示胸导ST-T段抬高为结扎成功。术后注射青霉素钠3×104U，每日1次，持续3 d，抗感染。常规喂养5 d后，第2周将饲料减至常规喂养量的1/2使大鼠饥饿，同时进行每日1次的力竭式游泳（大鼠游泳时间随状态的变差，力竭时间从初始3 h减少为30 min），持续4周。期间，大鼠出现精神萎靡，活动度减低，毛色无光泽、脱毛，甚者出现喉间哮鸣音等体征。经心脏彩超检测左室射血分数（EF）≤50%为CHF造模成功，列入下一步实验对象。由于此期眶内采血未成功，故将BNP的组间对照检测置于后期取材时进行检测。

1.4分组及给药其余43只造模成功的大鼠采用随机数字表求余法分为模型组（14只）、中药组（15只）、西药组（14只）。此时，空白组亦随机留取15只以尽量控制各组的样本量保持平衡状态。空白组和模型组分别给予常规等容积蒸馏水灌胃，每次3 mL，每日1次。用药组按照人鼠剂量换算公式给药。中药组按含生药9.2 g/（kg·d）的剂量给予益气活血复方灌胃，每日1次，西药组按生药1.5 mg/（kg·d）的剂量给予赖诺普利灌胃，每日1次，持续给药28 d。

1.5取材及检测方法由于灌胃给药期间模型组和治疗组（中药组、西药组）大鼠出现不同程度的死亡，每组大鼠仅剩余10只，因此，在后期的实验中每组大鼠取10只进行检测。大鼠持续给药28 d后，禁食不禁水12 h，腹腔麻醉大鼠，打开胸腔，取全心，按实验检测要求平均分成两份，于液氮中冷冻后在-80℃下保存待检。实时荧光定量PCR技术和蛋白免疫印迹法（Western blot）测定PGC-1α的基因和蛋白表达，比色法测定ATP浓度，酶联免疫吸附法（ELISA）测定BNP浓度。

1.6统计学方法应用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，各组间采用单因素方差分析（one-way AONVA），组间两两比较，若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1益气活血复方对大鼠心肌组织中BNP浓度的影响治疗组及模型组中BNP浓度均升高，与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.01），提示心力衰竭（以下简称心衰）时心肌组织内BNP的含量呈升高趋势。治疗组中BNP浓度降低，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01），说明药物治疗能够减少BNP的产生。中药组与西药组中BNP浓度比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明中、西药物的疗效相当。见表1。

2.2益气活血复方对CHF大鼠血浆中ATP浓度的影响治疗组及模型组中ATP浓度均减低，与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.01），提示心衰时心肌组织中ATP的含量呈降低趋势。治疗组中ATP浓度均升高，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01），说明药物治疗能够提高心肌组织中ATP的含量，促进能量的释放。中药组与西药组ATP浓度比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明中、西药物的疗效相当。见表1。

表1　各组大鼠血浆中BNP的浓度及ATP的浓度（x±s）

2.3益气活血复方对CHF大鼠心肌组织中PGC-1α表达的影响治疗组及模型组中PGC-1α mRNA的表达及蛋白表达均降低，与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.01），提示心衰时心肌组织内PGC-1α的含量呈降低趋势。治疗组中PGC-1α mRNA的表达及蛋白表达均升高，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01），说明治疗组药物能够提高心肌组织中PGC-1α的含量，提示药物治疗能够增加线粒体的生成。中药组与西药组PGC-1α mRNA的表达及蛋白表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明中、西药物的疗效相当。见表2、图1。

表2　各组大鼠心肌组织中PGC-1α mRNA及蛋白的表达（x±s）

图1　各组大鼠中PGC-1α蛋白表达

3　讨论

3.1PGC-1α、ATP与CHF的关系心脏是维持人体生命活动的重要器官，也是主要的耗能器官之一，在人体生命活动中扮演着重要角色。研究认为，能量代谢障碍是贯穿于心脏从心肌细胞代偿性肥大到心衰过程的重要因素之一。ATP是线粒体氧化的产物，作为能量产生的标志，可以监测组织的耗能状况，测定机体组织的供能正常与否。PGC-1α是近年来发现的与线粒体生物发生有关的主要协调因子之一，它作为调节线粒体生成的一种转录辅激活因子，参与线粒体的生物发生，对线粒体的生成起着至关重要的作用［3］。若心肌受损或长期处于高负荷工作状态，心脏做功的能量需求增加，会导致一系列代偿反应，如心肌细胞的代偿性肥大、心肌细胞内线粒体的不良增生等，直至心衰的发生。此过程中，心肌将供能不足的信号进行反射，促发心肌内PGC-1α的生物发生，增加线粒体DNA的表达和复制，促进ATP的释放，从而改善心肌能量代谢状况，减轻或预防心衰的发生。

3.2BNP与CHF的关系BNP广泛分布在脑、心脏、骨髓等器官组织内，以心脏含量最高，主要由心室肌合成分泌，具有利尿、利钠、扩血管、抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）等多种生物效应。BNP能够反映CHF的病情变化状况，心衰的等级越高，BNP的含量也越高，其预后较差［4-5］。本实验通过比较各组BNP的含量，证实心衰时BNP的含量升高，经过中药和西药治疗后，BNP的浓度相对降低，说明中药和西药两种药物对CHF均有一定的治疗作用。

3.3益气活血复方对CHF的影响中医学将心衰归属于“水肿”、“胸痹”、“悬饮”、“水饮”等范畴，认为心衰的发生为本虚标实，最终导致虚实夹杂的病证。虽各家理解的侧重点不同，但都认为心衰的发生与气虚、血瘀、水停有关［6-7］。王娟等［8］发现，在心衰的中医证候分型中，多数证型的组合，均有气虚血瘀证的发生。针对以气虚为本，血瘀、痰浊、水停为标的现象，吾师张艳推出具有益气活血、利水消肿作用的益气活血复方［9］。其中，黄芪补气，太子参气血双补，丹参、红花活血化瘀，益母草活血化瘀兼利水消肿，茯苓、葶苈子利水消肿。诸药合用，共奏益气活血、利水消肿、标本同治之功［10］。药理学认为，黄芪能够增强正性肌力、为细胞提供动能［11］，丹参能够改善能量代谢和抑制细胞凋亡［12］，太子参、红花、益母草能够保护心肌［13-15］，为本方能够调节心肌能量代谢提供了药理依据。

本实验证明：1）通过比较各组中BNP的浓度，证明心衰造模成功，中、西医两种药物在治疗慢性心衰上有疗效，并且疗效相当。2）在模型组中，PGC-1α的表达以及ATP的含量均低于其他3组，说明心衰发生时存在着影响线粒体生成和ATP供应相对不足的能量代谢障碍。3）在中药组和西药组中，PGC-1α的表达以及ATP的含量较模型组均升高，说明中西药物在治疗CHF时可以升高PGC-1α的表达，从而增加线粒体的生成，提高了线粒体的产能量，增加了ATP的输出。4）在中药组和西药组之间，PGC-1α的表达以及ATP的含量比较无统计学差异，说明中药组治疗后的指标疗效接近于西药组，能够达到所期望的治疗效果，值得推广应用。

综上所述，益气活血复方可以增加心肌线粒体的有效生成，提高心肌代谢所需能量的产生，从而改善和纠正CHF的发生［16］，为中医药防治CHF提供客观、可信的科学实验依据。

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Effects of Yiqi Huoxue prescription on myocardial energy metabolic with CHF rats after myocardial infarction

LIU Xiu-na1，ZHANG Yan2，LI Hai3
（1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；2.The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；3.The Second Chinese Medicine Hospital in Shenyang，Shenyang 110101，China）

［Objective］To study the effects of Yiqi Huoxue prescription on chronic heart failure（CHF）rats after myocardial infarction.［Methods］Twenty rats were selected from eighty healthy SD rats as the blank control group，and the rest was used to prepare CHF rat model by coronary artery ligation in combination with exhausted swimming and food reducing.By detecting the heart color doppler ultrasound and observing signs of changes in rats to determine whether building success.The successful molding rats were randomly divided into Chinese medicine group，Western medicine group and model group，blank control group（n=15）and model group（n=14）were given conventional volume distilled water by intragastric administration，1 time a day，the Chinese medicine group（n=15）was given 9.2 g/（kg·d）crude drugs dose of Yiqi Huoxue prescription every day by intragastric administration，Western medicine group（n=14）was given 1.5 mg/（kg·d）crude drugs dose of Lisinopril every day by intragastric administration.After continuous administration of 28 days，fast and only drink water for 12 hours，getting myocardial tissue and plasma.The concentration of BNP was detected by ELISA，and the concentration of ATP was detected by colorimetric method，using Real-time fluorescent quantitative PCR and immune protein imprinting method to detect PGC-1α gene and protein expression.［Results］Compared with the blank control group，the mRNA expression and the protein expression of PGC-1α and the concentration of ATP were decreased，while the concentration of BNP was increased in model，Chinese medicine and Western medicine group，showing statistical difference（P＜0.05）.Compared with the model group，the mRNA expression and the protein expression of PGC-1α and the concentration of ATP were decreased，while the concentration of BNP was increased in Chinese medicine and Western medicine group，showing statistical difference（P＜0.05）.Compared Chinese medicine group with the Western medicine group，the mRNA expression and the protein expression of PGC-1α and the concentration of ATP and the concentration of BNP had no obvious difference，showing there was no statistically significant difference between the groups（P＞0.05）.［Conclusion］Yiqi Huoxue prescription can activate the PGC-1α factor which is related to myocardial energy metabolism，increase the capacity of mitochondria，in order to improve and correct heart failure.

Yiqi Huoxue prescription；chronic heart failure；PGC-1α；ATP；BNP

R285.5

A

1673－9043（2015）01－0023-04

沈阳市科技创新专项资金项目（F13-316-1-10）。

刘秀娜（1987-），女，硕士研究生，主要从事中医药干预慢性心力衰竭机制及疗效的研究。

张艳，E-mail：yanzhang1016@126.com。

（2014-09-20）