杜立龙，徐宝山，杨强，马信龙，李秀兰，张杨，郭悦，丁晓明，祁霁舟，赵家宁

丝素蛋白来源的一体化纤维环-髓核支架的制备与评估

杜立龙1，2，徐宝山2△，杨强2，马信龙2，李秀兰2，张杨2，郭悦2，丁晓明1，2，祁霁舟1，2，赵家宁1，2

目的 评估以丝素蛋白为材料构建的一体化纤维环-髓核双相支架作为组织工程椎间盘支架的可行性。方法 以丝素蛋白溶液为原料，分别采用石蜡球致孔法和相分离法制备三维多孔一体化纤维环-髓核支架。采用体视显微镜、扫描电镜观察支架内部结构，测定双相支架纤维环相和髓核相的孔径、孔隙率及一体化压缩弹性模量；分离培养兔纤维环细胞和髓核细胞，接种至双相支架的相应部位，体外培养48 h，扫描电镜、死活（Live/dead）细胞染色评价支架与细胞的生物相容性；CCK-8检测细胞的增殖活性。结果 体视显微镜和扫描电镜可见双相支架纤维环相和髓核相均呈相互连通的多孔结构，孔隙高度连通，纤维环髓核交接区域结合紧密；纤维环相孔径为（220.0±23.1）μm，髓核相孔径为（90.0±17.8）μm；孔隙率分别为91%和93%；一体化支架压缩弹性模量为（150.7±6.8）kPa。扫描电镜可见均匀地黏附在支架表面，细胞周围有细胞外基质分泌；Live/dead染色显示细胞在支架上活性良好，无死细胞；CCK-8增殖分析显示纤维环细胞和髓核细胞均具有良好的增殖活性。结论 以天然丝素蛋白构建一体化纤维环-髓核双相支架，具有良好的孔径、孔隙率和细胞相容性，一体化支架两部分结合紧密，并且具有优越的力学性能，是构建组织工程椎间盘的理想支架载体。

组织工程；丝素蛋白；椎间盘；支架；纤维环；髓核

椎间盘退变性疾病是临床常见疾病，具有发病率高及致残率高的特点［1］。当前椎间盘退变性疾病的治疗措施主要有单纯髓核摘除、椎间盘切除及植骨融合固定等［2］。然而，这些措施只能暂时缓解症状，术后易复发、无法根治，甚至加速相邻节段退变，远期效果不尽满意，因此，需要探索理想的重建修复措施［3］。近年来组织工程技术成为研究的热点，有望为椎间盘疾病的治疗提供理想的修复措施［4］。选择合适的支架材料和种子细胞是构建组织工程椎间盘的关键［4］。丝素蛋白作为一种天然材料，具有优越的力学特性和生物降解性，已经广泛应用于骨和软骨组织工程［5-6］。本研究以丝素蛋白为材料，构建一体化纤维环-髓核支架，并分别复合纤维环细胞和髓核细胞，通过理化性能分析、力学分析、组织学观察及细胞生物相容性研究，探讨其作为组织工程椎间盘支架的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 新西兰大白兔4只，雌雄不限，质量约2 kg，用于椎间盘组织取材，由天津医院动物实验室提供。

1.2 主要试剂、仪器 桑蚕丝（江苏苏州）；LiBr、Na2CO3（天津市化学试剂三厂）；DMEM培养基、胎牛血清（Gibco，美国）；死活细胞（Live/dead）染色试剂（Invitrogen，美国）；扫描电子显微镜（SEM，Hitachi，日本）；激光共聚焦显微镜（Leica，TCS，德国）；酶标仪（iMark，Bio RAD，日本）；体式显微镜（Leica，S8APO，德国）；冷冻干燥机（北京博医康技术公司）。

Fig.1 Teflon mold of scaffold preparation图1 支架制备Teflon模具

1.3 一体化支架的制备 （1）丝素蛋白溶液的制备：桑蚕丝用0.02 mol/L的Na2CO3溶液脱胶，晾干后，溶解在9.3 mol/L LiBr溶液中，去离子水中透析3 d，15%聚乙二醇中浓缩，得到20%的丝素蛋白溶液［7］。（2）纤维环相的制备：采用特制的Teflon模具，将石蜡球加入模具中，见图1，然后将20%的丝素蛋白溶液加入石蜡球上方，并置于真空中以使丝素蛋白溶液均匀地渗透到石蜡球之间的孔隙中。（3）髓核相的制备：拔除模具中间的圆柱形不锈钢棒，迅速将7%丝素蛋白与15%乙醇的混合溶液注射到中间。将其置于-20℃中12 h，冻干48 h，取出丝素蛋白一体化支架，将其置于索氏萃取器中脱去支架中的石蜡球，室温下晾干，得到丝素蛋白一体化支架。

1.4 组织工程椎间盘的构建 （1）分离培养兔纤维环细胞和髓核细胞［8］。将大白兔处死后，立即皮肤消毒。背部正中切口，依次切开皮肤、皮下组织，暴露脊柱，分离脊柱周围附着的肌肉韧带；取出脊柱，切开椎间盘，分离出纤维环和髓核组织，Hank′s液（含100 U/mL青霉素和链霉素）漂洗3遍，剪碎成1 mm3组织块。用0.2%Ⅱ型胶原酶于37℃分别消化纤维环和髓核组织2～3 h和3～4 h，用200目滤网过滤，1 000 r/min离心10 min，所得的细胞沉淀以含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养液稀释一定倍数后，接种到培养瓶中。在37℃、5%CO2培养箱中培养，每3 d换液。（2）一体化支架经高温高压消毒后，浸泡DMEM（10%FBS）过夜。用滤纸吸干支架内的液体，将消化获得20 μL P2代髓核细胞（1×107个/mL）接种到一体化支架的髓核相，至其饱和；然后将消化获得20 μL P2代纤维环细胞（1×107个/mL）均匀接种到一体化支架的外周纤维环相。将上述细胞-支架复合物置37℃、5%CO2培养箱孵育3～4 h，使细胞充分贴壁；移至24孔板中培养，每天换液。

1.5 一体化纤维环-髓核支架的性能评估

1.5.1 大体观察 观察支架的大体形态、结构；将支架用刀片切成2 mm厚，于体式显微镜下观察。

1.5.2 扫描电镜观察 将支架切成厚1 mm薄片，临界点干燥，表面喷金处理后，于扫描电镜下观察。

1.5.3 支架孔径、孔隙率测定 孔径：取5个样本的100倍扫描电镜图片，每个样本随机读取5张不同视野图片，每张图片分别测量3个不同孔的直径，计算纤维环相和髓核相的孔径。孔隙率：分别取纤维环相和髓核相支架，采用液体置换法计算支架孔隙率（ε）［9］。将一定质量的样品置入盛有一定体积（V1）乙醇的刻度量筒中，循环抽真空至无气泡逸出，记录样品和乙醇的总体积V2；取出浸满乙醇的支架，剩余乙醇体积记为V3。ε=（V1-V3）/（V2-V3）×100%。测试5个平行样品，每个样品测3次，取均值。

1.5.4 细胞生物相容性检测 （1）扫描电镜观察：细胞-支架复合物培养48 h后，用2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脱水，临界点干燥，表面喷金，扫描电镜观察。（2）Live/dead染色观察：细胞-支架复合物培养48 h后，吸除培养液，PBS洗2遍，加入Live/dead染液，37℃、5%CO2培养箱孵育30 min，共聚焦显微镜下观察。（3）细胞增殖分析（CCK-8检测）：细胞-支架复合物分别培养至第1、3、5、7天后，移除培养液，PBS洗2遍，加入500µL CCK-8（10%）溶液，37℃孵育3 h，酶标仪检测波长在450 nm时的光密度（OD）值。

1.5.5 支架力学性能测试 支架浸入PBS中复水4 h以上，置于力学加载仪器上，以1 mm/min恒定速度进行压缩测试，计算机记录位移-载荷，绘制位移载荷曲线。取曲线起始较平缓阶段，计算压缩弹性模量。弹性模量=应力/应变。即：E=（F/S）/（dL/L），其中F代表截面的载荷，S代表截面面积，dL代表支架高度的变化，L代表支架原始高度。

1.6 统计学方法 应用SPSS 16.0进行统计分析，数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体及显微镜观察 一体化支架外径10 mm，呈圆柱状多孔结构；可见明显的双相结构，并且两相之间未见分离。体视显微镜下见一体化支架纤维环相和髓核相均呈多孔结构，孔径均匀，孔隙高度连通，交界区结合紧密，见图2A～C。

2.2 扫描电镜观察 可见双相支架纤维环相和髓核相均呈相互连通的多孔结构，孔隙高度连通，纤维环髓核交接区域结合紧密，见图2D～F。

2.3 支架孔径、孔隙率测定 纤维环相孔径为（220.0±23.1）μm，髓核相孔径为（90.0±17.8）μm；纤维环相髓核相孔隙率分别为91%和93%。

2.4 细胞生物相容性检测 扫描电镜可见细胞呈球状或短梭形均匀地黏附在支架表面及内部，细胞周围有细胞外基质分泌，见图3；Live/dead细胞染色显示细胞在支架上活性良好（绿色），无死细胞（红色），见图4；CCK-8增殖分析显示纤维环和髓核细胞在第1、3、5、7天时OD值比较差异均有统计学意义（F分别为58.470和22.940，均P＜0.01）；表明纤维环细胞和髓核细胞均具有良好的增殖活性，见图5 A。

2.5 支架力学性能测试 湿润状态下支架的典型载荷-位移曲线见图5B。取曲线起始部分，根据公式测得复水状态下，一体化支架压缩弹性模量为（150.7±6.8）kPa。

Fig.5 Cell metabolic activity and load-displacement curve图5 细胞增殖活性和载荷位移曲线

3 讨论

3.1 组织工程椎间盘的特点 椎间盘退变是引起腰痛、脊柱活动受限的主要原因。椎间盘退变主要表现在髓核组织细胞数量减少、细胞外基质脱水、力学性能减弱，同时伴随纤维环组织生化成分、微结构的紊乱、受力失衡，导致纤维环破裂，髓核突出，从而引起病变［10］。组织工程学方法为椎间盘退变提供了新的再生策略。当前组织工程椎间盘主要集中于研究单纯的髓核再生和单纯的纤维环再生［11］，而椎间盘退变是纤维环和髓核组织同时存在病变。因此，构建一体化的组织工程椎间盘成为当前的研究重点。

3.2 支架材料研究进展和选择 合适的支架材料是构建组织工程椎间盘的基础。理想的支架材料应该具备良好的生物相容性、适当的生物降解性以及优越的力学特性［12］。当前构建组织工程髓核的支架材料主要有藻酸盐、胶原-蛋白凝胶、脱细胞基质、Ⅱ型胶原/透明质酸/6-硫酸软骨素复合材料等［13］；构建组织工程纤维环的支架材料主要包括聚己内酯、透明质酸、聚乳酸、胶原、聚氨酯等［14］。然而这些研究局限于构建单纯的纤维环或者髓核组织。丝素蛋白作为一种天然材料，其不仅具有合适的生物降解性，并且具有优越的力学特性，已经广泛应用于骨、软骨组织工程。Mandal等［15］以丝素蛋白为材料制备三层仿生半月板支架，复合人成纤维细胞和软骨细胞，结果表明2种细胞均能在丝素支架上良好地生长增殖，并分泌大量的细胞外基质，提示丝素蛋白支架具有适合细胞生长的良好生物相容性。Meinel等［5］采用三维多孔丝素蛋白支架并复合间充质干细胞修复鼠颅盖骨缺损，通过检测基因表达、生化分析及X线分析等发现干细胞-丝素蛋白组织工程替代物能够很好地修复骨缺损，有利于骨重建和再生，并且具有良好的力学稳定性。本研究中，笔者在前期研究的基础上［16］，以天然丝素蛋白为材料，采用石蜡致孔法和相分离法2种不同方法，模拟天然椎间盘的结构和力学特性，并分别复合兔纤维环和髓核细胞，构建一体化组织工程椎间盘。

3.3 一体化支架的理化特性 理想的组织工程支架应具备合适的孔径、孔隙率以及高度连通的孔结构，以满足种子细胞的生长、增殖、浸润和细胞外基质的沉积。本研究以丝素蛋白为材料，采用石蜡致孔法和相分离法，经冷冻干燥构建一体化纤维环-髓核双相支架。结果显示纤维环相孔径适宜，孔隙率均较高；显微镜观察可见双相结构均具有高度连通的孔隙结构，并且在没有交联的情况下，交界区结合紧密牢固；这些指标均达到了理想支架材料的基本要求。椎间盘是一个复杂的受力组织器官，其对力学性能要求较高［17］。本实验中研究的丝素蛋白一体化支架经压缩测试，测得其压缩弹性模量为（150.7± 6.8）kPa，其在高度连通、较高的孔隙率的情况下，仍具有优越的力学性能，满足椎间盘移植早期的力学支撑的基本要求［18］，并且显著优于胶原蛋白、脱细胞基质等支架材料。尽管其压缩模量仍低于人正常天然椎间盘（238.7±68.0）kPa，但是其力学性能将会随着长期的细胞增殖、细胞外基质的分泌聚集及适当的力学刺激而逐渐增加，达到天然椎间盘的水平［19］。

3.4 一体化支架的细胞相容性 本实验中，细胞-支架复合物体外培养48 h后，扫描电镜发现2种细胞呈球状或短梭形均匀黏附于支架表面，表明支架有利于种子细胞的黏附生长和基质分泌。Live/ dead染色结果和CCK-8增殖分析显示2种均能保持良好的生长活性，并且均具有良好的增殖活性，这可能是由于一体化丝素蛋白支架没有有毒试剂的残留，无细胞毒性，具有优越的生物相容性，是组织工程纤维环-髓核的理想支架载体。

综上所述，采用石蜡致孔法和相分离法构建的一体化纤维环-髓核双相支架可以作为组织工程椎间盘支架，为构建一体化组织工程椎间盘提供了新的方向。但组织工程复合物在动物体内的生物功能、与周围组织的整合情况以及支架的降解情况仍需进一步研究。

（图2～4见插页）

［1］Hudson KD，Alimi M，Grunert P，et al.Recent advances in biological therapies for disc degeneration:tissue engineering of the annulus fibrosus，nucleus pulposus and whole intervertebral discs［J］.Curr Opin Biotechnol，2013，24（5）:872-879.doi:10.1016/j.copbio.2013.04.012.

［2］Li CQ，Huang B，Luo G，et al.Construction of collagen II/hyaluronate/chondroitin-6-sulfate tri-copolymer scaffold for nucleus pulposus tissue engineering and preliminary analysis of its physicochemical properties and biocompatibility［J］.J Mater Sci Mater Med，2010，21（2）:741-751.doi:10.1007/s10856-009-3871-5.

［3］Anderson PA，Rouleau JP.Intervertebral disc arthroplasty［J］.Spine，2004，29（23）:2779-2786.doi:10.1097/01.brs.0000146460.11591.8a.

［4］Silva-Correia J，Correia SI，Oliveira JM，et al.Tissue engineering strategies applied in the regeneration of the human intervertebral disk［J］.Biotechnol Adv，2013，31（8）:1514-1531.doi:10.1016/j.biotechadv.2013.07.010.

［5］Meinel L，Fajardo R，Hofmann S，et al.Silk implants for the healing of critical size bone defects［J］.Bone，2005，37（5）:688-698.doi: 10.1016/j.bone.2005.06.010.

［6］Chang G，Kim H J，Vunjak-Novakovic G，et al.Enhancing annulus fibrosus tissue formation in porous silk scaffolds［J］.J Biomed Mater Res A，2010，92（1）:43-51.doi:10.1002/jbm.a.32326.

［7］ Zhu M，Wang K，Mei J，et al.Fabrication of highly interconnected porous silk fibroin scaffolds for potential use as vascular grafts［J］.Acta Biomater，2014，10（5）.doi:10.1016/j.actbio.2014.01.022.

［8］Li J，Liu C，Guo Q，et al.Regional variations in the cellular，biochemical，and biomechanical characteristics of rabbit annulus fibrosus［J］.PloS One，2014，9（3）:e91799.doi:10.1371/journal.pone.0091799.

［9］Nazarov R，Jin HJ，Kaplan DL.Porous 3-D scaffolds from regenerated silk fibroin［J］.Biomacromolecules，2004，5（3）:718-726.doi: 10.1021/bm034327e.

［10］O'Halloran DM，Pandit AS.Tissue-engineering approach to regenerating the intervertebral disc［J］.Tissue Eng，2007，13（8）:1927-1954.doi:10.1089/ten.2005.0608.

［11］Iatridis JC，Nicoll SB，Michalek AJ，et al.Role of biomechanics in intervertebral disc degeneration and regenerative therapies:what needs repairing in the disc and what are promising biomaterials for its repair［J］？Spine J，2013，13（3）:243-262.doi:10.1016/j.spinee.2012.12.002.

［12］Zhang L，Li QJ，Zhao JH，et al.Growth characteristics and functional changes in rat chondrocytes cultured in porous tantalum in vitro ［J］.Med J Chin PLA，2014，39（6）:464-469.［张岭，李琪佳，赵季华，等.医用多孔钽材料复合大鼠软骨细胞的生长特性及功能变化［J］.解放军医学杂志，2014，39（6）:464-469］.

［13］Yang X，Li X.Nucleus pulposus tissue engineering:a brief review ［J］.Eur Spine J，2009，18（11）:1564-1572.doi:10.1007/s00586-009-1092-8.

［14］Jin L，Shimmer AL，Li X.The challenge and advancement of annulus fibrosus tissue engineering［J］.Eur Spine J，2013，22（5）:1090-1100.doi:10.1007/s00586-013-2663-2.

［15］Mandal BB，Park SH，Gil ES，et al.Multilayered silk scaffolds for meniscus tissue engineering［J］.Biomaterials，2011，32（2）:639-651.doi:10.1016/j.biomaterials.2010.08.115.

［16］Zhao JN，Xu BS，Zeng C，et al.A study of porous silk fibroin scaffolds with rabbit nucleus pulposus cells for the construction of tissue-engineered nucleus pulposus in vivo［J］.Tianjin Med J，2014，42（11）:1076-1079.［赵家宁，徐宝山，曾超，等.新型丝素蛋白支架复合兔髓核细胞体内初步构建组织工程髓核的研究［J］.天津医药，2014，42（11）:1076-1079］.

［17］Nerurkar NL，Elliott DM，Mauck RL.Mechanical design criteria for intervertebral disc tissue engineering［J］.J Biomech，2010，43（6）: 1017-1030.doi:10.1016/j.jbiomech.2009.12.001.

［18］Whatley BR，Wen X.Intervertebral disc（IVD）:Structure，degeneration，repair and regeneration［J］.Mat Sci Eng C-Mater，2012，32 （2）:61-77.doi:10.1016/j.msec.2011.10.011.

［19］Jacobs NT，Smith LJ，Han WM，et al.Effect of orientation and targeted extracellular matrix degradation on the shear mechanical properties of the annulus fibrosus［J］.J Mech Behav Biomed Mater，2011，4（8）:1611-1619.doi:10.1016/j.jmbbm.2011.03.016.

（2014-12-28收稿 2015-01-21修回）

（本文编辑 李鹏）

Manufacture and evaluation of integrated biphasic silk fibroin scaffold made by annulus fibrosus-nucleus pulposus tissue engineering

DU Lilong1，2，XU Baoshan2△，YANG Qiang2，MA Xinlong2，LI Xiulan，ZHANG Yang2，GUO Yue2，DING Xiaoming1，2，QI Jizhou1，2，ZHAO Jianing1，2
1 Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Tianjin Hospital
△Corrsponding Author E-mail：xubaoshan99@126.com

Objective To assess the prospect of integrated biphasic silk fibroin scaffold made by annulus fibrosus-nucleus pulposus tissue engineering in application as integrated intervertebral disc（IVD）.Methods An integrated annulus fi brosus-nucleus pulposus（AF-NP）biphasic scaffold was made by silk fibroin using two different uncomplicated methods which were paraffin spheres-leaching method（outer AF phase）and phase separation method（inner NP phase）.The scaffold was investigated by general observation，stereomicroscope and scanning electron microscopy（SEM）.Its pore size，porosity，and compressive elastic modulus were determined.AF and NP cells were isolated from rabbit IVD and seeded into the corresponding phase of the scaffold respectively.The cell-scaffold complex was cultured for 48 hours.The biocompatibility of the scaffold was evaluated by SEM，live/dead staining while CCK-8 assay was used to assess cell proliferation.Results Stereomicroscope and SEM showed that AF phase and NP phase integrated perfectly without cross-linking.Both phases possessed highly interconnected porous structure［pore size of AF and NP phase were（220.0±23.1）μm and（90.0±17.8）μm，respectively］and highly porosity（AF and NP phase were respectively 91%and 93%）.In addition，this silk biphasic scaffold had impressive mechanical properties（150.7±6.8）kPa.SEM revealed that disc cells attached to regions of pore walls，distributed uniformly and secreted extracellular matrix.Live/Dead staining and cell count kit-8（CCK-8）analysis showed that the silk composite scaffold was non-cytotoxic to disc cells.Conclusion This silk biphasic AF-NP scaffold has satisfied pore size，porosity，biomechanical properties and biocompatibility，so it is ideal candidate for IVD tissue engineering.

tissue engineering；silk；intervertebral disk；scaffold；annulus fibrosus；nucleus pulposus

R318.17，R329-33

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.007

国家自然科学基金资助项目（81272046，31300798，31470937）；中国博士后科学基金项目（2011M500530，2012T50221）；天津市卫生局攻关课题（14KG121）

1天津医科大学研究生院（邮编300070）；2天津市天津医院

杜立龙（1988），男，硕士在读，主要从事脊柱外科、组织工程椎间盘研究

△E-mail：xubaoshan99@126.com