于冬梅, 丁 爽, 尚 勇, 罗 赛, 徐海倩, 郝立君

瘢痕研究

瘢痕疙瘩中人端粒酶逆转录酶和caspase- 3基因的表达及意义

于冬梅, 丁 爽, 尚 勇, 罗 赛, 徐海倩, 郝立君

目的 研究瘢痕疙瘩成纤维细胞中人端粒酶逆转录酶和caspase- 3的表达及二者间的关系，以及两种因子与瘢痕疙瘩发生、发展机制的关系。方法 以普通瘢痕为对照，采用RT- PCR和蛋白免疫印染法，研究瘢痕疙瘩成纤维细胞中，人端粒酶逆转录酶、caspase- 3 mRNA和蛋白表达的变化，并进行比较分析。结果 瘢痕疙瘩成纤维细胞中，人端粒酶逆转录酶的mRNA和蛋白表达水平高于普通瘢痕(P<0.01)；而活化caspase- 3的表达水平活性显著低于普通瘢痕(P<0.05)。结论 人端粒酶逆转录酶和caspase- 3在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达存在异常，它们对瘢痕疙瘩形成过程中的成纤维细胞异常增殖和凋亡起着重要的作用。

瘢痕疙瘩； 人端粒酶逆转录酶；caspase- 3

瘢痕疙瘩是皮肤损伤后组织病理性修复的结果。研究表明，瘢痕疙瘩中成纤维细胞的增殖- 凋亡调控的失衡是导致瘢痕疙瘩不断增生,难以退化的细胞学基础[1- 3]。端粒酶是一种逆转录酶，其活性与细胞的无限增殖存在密切的关系。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)是端粒酶组成成分之一，且hTERT的表达与端粒酶的活性呈平行关系[4]。Caspas- 3的活化被认为是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志[5]。因此，研究两者在瘢痕疙瘩中的表达，将为探讨瘢痕疙瘩的发生机制提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 对象来源 选择2012年5月至2014年5月在我院行手术治疗的60例患者。瘢痕疙瘩组30例。男性4例，女性26例；平均年龄32岁。部位分布：胸部15例，肩部3例，耳垂部12例。无明显创伤史，具有家族史；普通瘢痕组30例。男性17例，女性13例；平均年龄35岁。为3年以上的扁平瘢痕。两组均经临床及病理确诊。患者均签署知情同意书。

1.2 试剂 TRIzol试剂盒购自美国INVITROGEN公司；逆转录系统试剂盒、TaqDNA聚合酶购自美国PROMEGA公司；引物由上海生物工程技术有限公司合成；鼠抗人hTERT单克隆抗体、兔抗人caspas- 3单克隆抗体购自美国SANTA CRUZ公司。1.3 RT- PCR测定目的基因mRNA表达 将手术切除的瘢痕组织，分别用TRIzol提取总RNA，所得样品经凝胶电泳验证后，将合格样品迅速参照逆转录试剂盒合成cDNA。扩增目的基因引物序列(表1)，反应条件为94 ℃ 40 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共32个循环。以B- actin内参照，检测转录效率。PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成象系统观察拍照。1.4 Western blot测定目的基因蛋白表达 将手术切除的瘢痕组织制成组织匀浆，分别提取总蛋白，100 ℃煮沸变性5 min，样品通过12%SDS- PAGE分离后转至PVDF膜上，加入一抗，4 ℃过夜，用TBST洗膜10 min，3次，加入11∶20稀释的生物素化二抗工作液，室温振摇1 h，TBST洗膜后，加入11∶20稀释的辣根过氧化酶标记链霉卵白素工作液，室温振摇1 h，TBST洗膜10 min，3次，用DAB室温避光显色，至理想条带出现，水冲洗，膜保存于PBS中照相。最后以图像分析系统测定各条带灰度值，以β- tubulin作为内参照，以此反映目的蛋白的表达程度。

1.5 统计学处理 各组结果采用组间比较t检验，运用SPSS13.0软件对数据进行统计学分析,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RT- PCR检测目的基因mRNA的表达 RT- PCR反应条件优化确定后，以普通瘢痕组为对照，以B- actin作为内参照，将瘢痕疙瘩组织总RNA逆转录的cDNA模板调整相对一致，然后以调整的模板扩增目的基因(图1，2)。在RNA模板量、实验条件、反应条件一致的情况下，特异电泳条带经计算机灰度扫描定量后，计算各组比值。结果发现，瘢痕疙瘩成纤维细胞目的基因hTERTmRNA的含量与普通瘢痕组比较，P<0.01为差异具有显著的统计学意义，而两者的caspase- 3电泳条带亮度无明显差异。2.2Westernblot测定目的基因蛋白表达 各组结果显示，内参照B-tublin(51kD)杂交带亮度相似，在位于120kD蛋白条带位置均呈现hTERT特异性蛋自杂交带的表达，但亮度有明显差异，瘢痕疙瘩组的蛋自条带亮度明显高于普通瘢痕组(P<0.05)，而caspase- 3蛋白的分子量为32kD，活化时降解成分子量为17kD和12kD两个亚单位，但免疫印染分析往往只能检测到17kD的亚单位，实验发现瘢痕疙瘩组仅32kD的caspase- 3特异蛋白条带亮度明显高于普通瘢痕，而17kD亚单位条带亮度在普通瘢痕组中明显增高，表明caspase- 3活性被激活(P<0.05，图3)。

3 讨论

瘢痕疙瘩因其具有持续性生长、无自限性及切除后易复发的临床特点，被很多学者视为一种肿瘤而进行研究。瘢痕组织内最主要的功能细胞----成纤维细胞的异常高、增殖低和凋亡的特征性生物学行为被认为是瘢痕形成过程的重要因素[6- 9]。

端粒是位于真核细胞染色体末端的核酸- 蛋白复合体，具有维持染色体结构和功能的完整性及稳定性的作用，与细胞的增殖及凋亡密切相关。端粒酶是维持端粒稳定的重要因素，hTERT是端粒酶活性的限速决定因子[10- 12]。研究结果显示，瘢痕疙瘩组织中hTERT的表达明显高于普通瘢痕，两组比较具有统计学意义，表明hTETR表达上调与瘢痕疙瘩成纤维细胞的异常增殖密切相关。

表1 引物序列和片段长度

图1 hTERT和β- actinPCR产物电泳结果(M:marker;1～3:瘢痕疙瘩;4～6:普通瘢痕) 图2 caspase- 3和β- actinPCR产物电泳结果(M:marker;1～3:瘢痕疙瘩;4～6:普通瘢痕) 图3 hTERT、caspase- 3和β- tubulin Western blot结果(1～3:瘢痕疙瘩;4～6:普通瘢痕)

Fig 1 PCR products of hTERT and β- actin (M:marker; 1～3:keloid; 4～6:scars). Fig 2 PCR products of caspase- 3 and β- actin (M:marker; 1～3:keloid; 4～6:scars). Fig 3 Westem blot results of hTERT, caspase- 3 and β- actin (1～3:keloid; 4～6:scars).

同时，caspase- 3是细胞凋亡的核心机制，通过级联式激活而发挥生物学效应，一旦激活，便“开启”凋亡级联反应，使细胞发生不可逆的凋亡进程[13- 15]。研究表明，瘢痕疙瘩和普通瘢痕组织中，caspase- 3 mRNA的表达无显著差异，而在蛋白水平，普通瘢痕组织中存在被激活的caspase- 3，两组比较具有统计学意义，caspase- 3的激活障碍与瘢痕疙瘩成纤维细胞的异常凋亡密切相关。

本实验通过探讨瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡的关键因子，对瘢痕疙瘩形成机制进行探究，但如何准确调控hTERT、激活caspase- 3以及如何控制信号传导使细胞向凋亡方向进行将是下一步的研究重点。

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Expressions of human telomerase reverse transcriptase and caspase- 3 in keloid and its significance

YUDong-mei,DINGShuang,SHANGYong,etal.

(PlasticandCosmeticCenter,TheFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Objective To study the expression and relationships of human telomerase reverse transcriptase and caspas- 3 gene in keloid derived fibroblasts and the relationships between the expression of two genes and the occurrence & development mechanism of the keloid. Methods The normal scar as the control group, the changes of human telomerase reverse transcriptase and caspase- 3 expression were detected by semi- quantitative RT- PCR and Western blot methods, then the results were analyzed. Results Compared with scar, The expression of mRNA and protein of human telomerase reverse transcriptase was higher in fibroblasts of keloid (P<0.01),buttheexpressionofactivatedcaspase- 3wassignificantlower(P<0.05). Conclusion The expression of human telomerase reverse transcriptase and caspase- 3 in fibroblasts of keloid is abnormal, they play important roles in the abnormal proliferation and apoptosis of fibroblasts in the course of keloid.

Keloid; Human telomerase reverse transcriptase; Caspase- 3

黑龙江省青年科学基金资助项目(QC2011C116)

150001 黑龙江 哈尔滨，哈尔滨医科大学附属第一医院 整形美容中心

于冬梅(1977- )，女，黑龙江人，副主任医师，博士研究生.

郝立君，150001，哈尔滨医科大学附属第一医院 整形美容中心，电子信箱：lijunhao368@163.com

10.3969/j.issn.1673- 7040.2015.03.002

R

A

1673- 7040(2015)03- 0132- 03

2014- 12- 10)