张安强王小臣王星丽瞿 亮孙培龙*马 新

（1.浙江工业大学海洋学院，杭州 310014；2.杭州百山祖生物科技有限公司，杭州 310052）

冬虫夏草多糖抗氧化活性及其单糖组成的研究

张安强1王小臣1王星丽2瞿 亮2孙培龙1*马 新1

（1.浙江工业大学海洋学院，杭州 310014；2.杭州百山祖生物科技有限公司，杭州 310052）

利用超声辅助提取法和分级醇沉得到3种醇沉组分粗多糖CSP40、CSP60和CSP80，并分析这3种组分的抗氧化活性。活性较好的粗多糖CSP40经过DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱层析和Sephacryl S-400凝胶柱层析纯化得到单一组分CSP40-2a，进行乙酰化处理后用GC-MS测得其单糖组成。结果表明，超声辅助提取所得的3个醇沉组分均具有较好的抗氧化活性，从强到弱依次为 CSP40＞CSP80＞CSP60。乙酰化分析表明，CSP40-2a主要由3种单糖组成，分别是D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖，其摩尔比为1.98︰1.0︰0.67。

冬虫夏草；多糖；抗氧化活性；多糖纯化；单糖组成

多糖是生物体内重要的大分子活性化合物，与维持生物机能密不可分[1]。近年来，诸多研究表明，真菌多糖具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗炎症等生物活性，同时对机体温和无害[2]。因此，真菌多糖正逐渐成为功能性食品和新药开发的重要研究方向之一。

冬虫夏草[Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc]为麦角菌科（Clavicipiraceace）虫草属（Cordyceps）的传统食药用菌[3]，主要生长于青藏高原、云贵高原等海拔3 500米以上的高山草甸土中。虫草含有丰富的生物活性物质，具有极高的营养价值和独特的药用价值[4]。但因其特殊的寄生习性和严苛的生长环境，野生虫草资源十分稀少，市场价格非常昂贵。现阶段工业上多采取发酵法获取冬虫夏草菌丝体作为相关产品生产的原料[5]。但大多数产品均为冬虫夏草菌丝体粗制品，缺乏精细加工和深入研究，不能满足市场的需求。

国内外学者对虫草中的活性物质做了较多的研究，但不同类型、不同产地、不同培养条件的虫草，其活性物质存在一定的差异。C.H. Dong 等[6]研究表明，野生型与人工培养型虫草的抗氧化活性有所不同。马赟等[7]报道不同产地的新疆虫草清除羟基自由基、超氧阴离子的能力和还原力具有一定的差异。罗建光[8]研究表明，发酵条件对冬虫夏草菌丝体中多糖、腺苷、尿苷、虫草素的含量和抗氧化、增强免疫等生物活性有较大影响。另外，多糖作为一种具有较好生物活性的高分子复合物，其化学组成和结构具有一定的复杂性。因此，厘清冬虫夏草中种类丰富的多糖的构效关系并用于指导功能性食品和新药的开发已成其当前研究的重点和难点。

1　实验材料与试剂、仪器

1.1实验材料

冬虫夏草菌丝体粉，由浙江省杭州市百山祖生物科技有限公司提供。

1.2实验试剂与仪器

DPPH、ABTS、脱氧核糖、硼氢化钠、二甲基亚砜、三氟乙酸、碘甲烷及单糖标准品购于美国Sigma公司。填料DEAE-Sepharose Fast Flow 和Sephacryl S-400 购于美国GE公司。氯仿、甲醇、乙醇、乙酸、醋酐、甲苯、无水硫酸钠等均为国产分析纯。

高效液相色谱仪（2695）购于美国Waters公司，气相-质谱联用仪（Finnigan Trace Ultra-DSQ II）购于美国Thermo Fisher公司，紫外-可见光光度计（UV-2450）购于日本岛津公司。

2　实验方法

2.1虫草粗多糖提取

称取100 g冬虫夏草菌丝体干粉，脱脂处理后用超声辅助法提取多糖。提取液离心过滤后经40%、60%、80%分级醇沉得到CSP40、CSP60、CSP80三种粗多糖。

2.2抗氧化活性测定

（1）样品溶液的配制。分别将冬虫夏草多糖分级醇沉组分CSP40、CSP60、CSP80配成0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、5.0 mg/mL 7个浓度的多糖溶液备用。

（2）DPPH自由基清除能力测定[9]。分别取不同浓度的多糖溶液2 mL与1 mL 0.2 mmol/L DPPH-甲醇溶液在25 ℃恒温环境避光反应1 h，然后在517 nm处测定吸光值。以同体积的蒸馏水替代多糖溶液作为空白对照组，测得吸光度；以同体积甲醇代替DPPH试剂作为样品对照组，以消除多糖溶液自身对吸光值的影响。清除率计算公式为：。

（3）ABTS自由基清除能力测定。ABTS工作液按Roberta Re[10]报道的方法配制。取不同浓度的多糖溶液1 mL，分别与3 mL ABTS工作液在暗处反应1 h，在734 nm波长处测得吸光值；以1 mL 纯水代替样品，在相同条件下测得吸光值；以3 mL 纯水替代ABTS自由基溶液作为样品对照组在相同条件下测得吸光值。清除率计算公式同上。

（4）羟基自由基清除能力测定。采用Fenton反应产生羟基自由基，利用分光光度法测定粗多糖CSP40、CSP60、CSP80的羟基自由基清除能力[9]。

（5）还原力测定。采用普鲁士蓝法[11]测定CSP40、CSP60、CSP80的还原力。样品中抗氧化剂将铁氰化钾还原成二价铁，二价铁进一步与FeCl3反应生成在700 nm处有最大吸光度的普鲁士蓝（Fe4[Fe(CN)6]3）。

2.3粗多糖CSP40的纯化

采用 DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱层析，分别用蒸馏水和0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.4 mol/L、1.0 mol/L NaCl溶液对CSP40进行梯度洗脱。每10 mL收集一试管，并用苯酚-硫酸法测定其吸光值。以吸光值为纵坐标，管数为横坐标绘制总洗脱曲线。收集0.1 mol/L NaCl洗脱峰组分，脱盐并冷冻干燥后得到CSP40-2。

采用Sephacryl S-400凝胶柱对CSP40-2样品进行进一步纯化，每5 mL收集一试管，并用苯酚-硫酸法测定其吸光值。以吸光值为纵坐标，以管数为横坐标绘制洗脱曲线图。

收集洗脱峰处组分，用高效液相色谱鉴定其纯度。

2.4CSP40-2a的单糖组成测定

（1）单糖标准品的乙酰化处理。精确称量2 mmol鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖溶于 3 mL蒸馏水中。用NaBH4还原单糖混标，多余的NaBH4可与甲醇共蒸去除。单糖被还原成糖醇后，再用醋酐乙酰化成糖醇乙酸酯衍生物[12]。乙酰化产物溶于氯仿后用纯水萃取除杂，氯仿层加入无水硫酸钠除水干燥。上清液定容到10 mL，待GC-MS分析。

（2）CSP40-2a的乙酰化处理。精确称量纯多糖CSP40-2a 2 mg，置于梨形瓶中，加入4 mL三氟乙酸（2 mol/L，TFA）混匀后在110 ℃下密封水解2 h。水解完成后冷却至室温，40 ℃减压蒸干，重复4～5次以除去三氟乙酸。然后按照步骤2.4（1）进行还原和乙酰化，并用氯仿溶解定容至5 mL，待GC-MS分析。

（3）GC-MS条件[13]。柱温从120 ℃以10 ℃/min升温至240 ℃，保持 6.5 min。接口温度250 ℃，离子源温度为250 ℃，进样量1.0 μL，以氦气作为载气，流速为1.0 mL/min，质量扫描范围为40～500 amu，扫描时间为0.28 s。

3　结果与分析

3.1虫草多糖的抗氧化活性

（1）DPPH自由基清除能力。不同浓度虫草多糖醇沉组分的清除DPPH自由基的能力如图1 （a）所示，Vc为阳性对照。CSP40、CSP60、CSP80清除DPPH自由基的能力均随着浓度的升高而增强，且两者具有一定的量效关系。在多糖浓度为5 mg/mL时，CSP40的DPPH自由基清除率最高，为 61.04±3.14%；CSP80稍次，为57.64±2.00% ； CSP60最 弱 ， 清 除 率 为48.19±1.78%；而此时的阳性对照组Vc的清除率为100%。在样品浓度<3.0 mg/mL的低浓度范围下，CSP40组分的 DPPH自由基清除能力强于CSP80组分，CSP60组分较弱。

图1　虫草多糖抗氧化活性

（2）ABTS自由基清除能力。不同浓度的虫草多糖醇沉组分清除羟基自由基的能力如图 1（b）所示，Vc为阳性对照。CSP40、CSP60、CSP80组分均显示了较好的ABTS自由基清除能力，其自由基清除能力和浓度间存在显著的量效关系。CSP40组分的ABTS自由基清除能力随样品浓度的增加，上升最快，1.5 mg/mL时达到高值，其清除率为92.08±3.29%；CSP80次之，在 2.0 mg/mL达到高值，清除率为89.26±1.40%；CSP60升幅较缓，在浓度为 2.5 mg/mL时，清除率为46.48±2.95%。在同样浓度下，CSP40、CSP80组分和阳性对照Vc的清除率均接近100%。

（3）羟基自由基清除能力。不同浓度的虫草多糖醇沉组分清除羟基自由基的能力如图 1 （c）所示，Vc为阳性对照。CSP40、CSP60、CSP80组分的清除能力均随着样品浓度的升高而逐渐增强。在样品浓度达到5 mg/mL时，CSP40的羟基自由基清除率在三组分中为最高，达63.90 ±4.14%；CSP80次之，为 56.90±2.33%；CSP60较低，为 40.40±3.46%。而此时的阳性对照 Vc羟基自由基清除率为100%。在样品浓度低于2.5 mg/mL的低浓度区域，CSP40的羟基自由基清除能力远高于CSP60与CSP80组分。在样品浓度高于2.5 mg/mL的高浓度区域，CSP80组分的羟基自由基清除能力随着浓度的升高而有较大提高。

（4）还原力。研究表明，多糖的抗氧化活性与其还原力具有很强相关性。抗氧化活性还与还原酮类物质有关，该类物质可为终止自由基的链式反应提供氢原子[11]。

不同浓度的虫草多糖醇沉组分还原力如图 1 （d）所示，Vc为阳性对照。CSP40、CSP60和CSP80的还原力与样品浓度均具有显著的量效关系。其中，CSP40还原力大于CSP80，CSP80大于CSP60。

图2　冬虫夏草多糖CSP40洗脱曲线

但CSP40、CSP60、CSP80组分均具有较好的抗氧化活性，且随着浓度的升高而增强。CSP40、CSP60、CSP80对DPPH、ABTS自由基的清除能力较强，而对羟基自由基的清除能力则较弱。综合上述4种指标评估，该3种粗多糖的抗氧化活性从高到低排序为：CSP40＞CSP80＞CSP60。

3.2虫草多糖CSP40的纯化

（1）离子交换柱层析。由上述实验可知虫草多糖CSP40组分均具有较好的抗氧化活性，因此分离纯化出一种活性纯多糖，对进一步探究多糖构效关系有着重要的意义。

虫草多糖CSP40洗脱曲线如图2所示。虫草多糖CSP40经过DEAE-Sepharose Fast Flow分离后可得4个组分，分别为CSP40-1、CSP40-2、CSP40-3和CSP40-4。由图2可知，CSP40-2峰形瘦高，对称性好，峰面积大，含量较多，故收集该组分用于下一步实验。收集的洗脱液经Sephadex G25凝胶柱脱盐后再作进一步纯化。

（2）凝胶柱层析。由上一步得到的CSP40-2洗脱组分经 Sephacryl S-400 凝胶柱层析的洗脱曲线如图3所示。收集第14～19管洗脱液并冷冻干燥后命名为CSP40-2a。经HPLC检测，其峰形为单一对称峰，证明为均一多糖组分[13]。

3.3CSP40-2a的单糖组成分析

（1）单糖混标的乙酰化。C-MS总离子流图如图4所示。混标中各单糖保留时间见表2，其中RSD1为6次重复进样的相对标准偏差；RSD2为6次平行实验的相对标准偏差。经计算，RSD1与RSD2均小于5%，说明乙酰化分析重现性良好，GC-MS仪器稳定可靠。另由平均峰面积的百分含量可计算出各单糖组分相对于该仪器的响应因子。

混标中各单糖出峰时间从左到右分别是鼠李糖、海藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。

（2）CSP40-2a 的乙酰化。多糖 CSP40-2a乙酰化后经GC-MS测得总离子流图如图5所示。对照单糖乙酰化衍生物GC-MS总离子流图和出峰的时间表可知，CSP40-2a主要由三种单糖组成，分别是D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖，其摩尔比为1.98︰1.0︰0.67。

4　结 论

图3　CSP40-2 Sephacryl S-400凝胶柱层析洗脱曲线

表2　混合标准品GC-MS结果

图4　单糖混标乙酰化衍生物GC-MS总离子流图

图5　CSP40-2a乙酰化衍生物总离子流图

本研究采用超声辅助提取工艺，并利用分级醇沉法得到 3种虫草粗多糖 CSP40、CSP60、CSP80。通过抗氧化活性实验得知，三者均具有较好的抗氧化活性，且随着浓度的升高而增强。CSP40、CSP60和CSP80对DPPH和ABTS自由基的清除能力较强，而对羟基自由基的清除能力略弱。总体上，抗氧化活性从高到低排序为：CSP40＞CSP80＞CSP60。抗氧化活性较好的粗多糖CSP40经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析分离得到 CSP40-2组分，CSP40-2组分再经Sephacryl S-400凝胶柱层析可得单一多糖组分CSP40-2a。利用GC-MS进行乙酰化分析得知 CSP40-2a主要由 D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖三种单糖组成，其摩尔比为 1.98︰1.0︰0.67。本文探究虫草多糖抗氧化活性，并成功探索出一条从虫草菌丝体中分离生物活性纯多糖的工艺路线，为进一步揭示其构效关系和指导虫草菌丝体的精细加工奠定了一定的基础[14]。

[1] 王涛, 赵谋明, 多糖的研究进展[J]. 现代食品科技, 2007, 23(1): 103-106.

[2] 周明, 史德芳, 郭鹏, 等. 食药用菌多糖抗肿瘤活性的分析比较(综述)[J]. 食药用菌, 2012, 02: 78-82.

[3] Chen Peter-xin, Wang Su-nan, Nie Shao-pin et al. Properties of Cordyceps Sinensis: A review [J]. Journal of Functional Foods, 2013, 5(2): 550-569.

[4] 程维蓉, 段丽红, 郑必胜. 冬虫夏草及其多糖的研究与应用进展[J]. 现代食品科技, 2006, 22(4): 284-286.

[5] 劳景辉, 闫文娟, 方佳茂, 等. 冬虫夏草发酵技术的研究进展[J]. 中国食用菌, 2012, 31(6): 5-7.

[6] Dong C.-H, Yao Y.-J. In vitro evaluation of antioxidant activities of aqueous extracts from natural and cultured mycelia of Cordyceps sinensis [J]. LWT-Food Science and Technology, 2008, 41(4): 669-667.

[7] 马赟, 索菲娅, 卢帅, 等. 不同产地新疆虫草体外抗氧化作用[J]. 中国医院药学杂志, 2014, 34(14): 1145-1148.

[8] 罗建光. 液体发酵条件对虫草（Cordyceps sinensis）菌丝体有效成分、免疫及抗氧化活性的影响[D]. 上海师范大学.

[9] Yang Bao, Wang Jin-shui, Zhao Mou-ming et al. Identification of polysaccharides from pericarp tissues of litchi (Litchi chinensis Sonn.) fruit in relation to their antioxidant activities [J]. Carbohydrate Research, 2006, 341(5): 634-638.

[10] Roberta Re, Nicoletta Pellegrini, Anna Proteggente et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay [J]. Free Radical Biology and Medicine, 1999, 26(9-10): 1231-1237.

[11] Dou Jiao, Meng Yong-hong, Liu Lei et al. Purification, characterizationandantioxidantactivitiesof polysaccharidesfromthinned-youngapple[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2015, 72(0): 31-40.

[12] Chen Yi, Zhang Hui, Wang Yuan-xing et al. Acetylation and carboxymethylation of the polysaccharide from Ganodermaatrumandtheirantioxidantand immunomodulating activities [J]. Food Chemistry, 2014, 156(0): 279-288.

[13] Liu Ji-cheng, Sun Yong-xu, Yu Hai-tao et al. Purification and identification of one glucan from golden oyster mushroom (Pleurotus citrinopileatus (Fr.) Singer) [J]. Carbohydrate Polymers, 2012, 87(1): 348-352.

[14] Zhang An-qiang, Liu Ye, Xiao Nan-nan et al. Structural investigation of a novel heteropolysaccharide from the fruiting bodies of Boletus edulis [J]. Food chemistry, 2014, 146(1): 334-338.

Antioxidant activities and monosaccharide composition analysis of Cordyceps sinensis polysaccharides

Zhang Anqiang1Wang Xiaochen1Wang Xingli2Qu Liang2Sun Peilong1Ma Xin1

(1.Ocean College, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China; 2. Hangzhou Baishanzu Biological Science and Technology Co. Ltd, Hangzhou 310052, China)

Three crude polysaccharide sections named CSP40, CSP60 and CSP80 were obtained by ultrasonic-assisted extraction and grading alcohol precipitation. Antioxidant activities of these three sections were tested and the most active section CSP40 was purified by DEAE-Sepharose Fast Flow and Sephacryl S-400 chromatography. The monosaccharide composition of the pure polysaccharide named CSP40-2a was analyzed by GC-MS after acetylation. Result showed that CSP40, CSP60 and CSP80 had a good ablility of antioxidant and the order was CSP40>CSP80>CSP60. Acetylating analysis by GC-MS indicated that CSP40-2a was composed of D-Mannose, D-Glucose and D-Galactose at the rate of 1.98: 1.0: 0.67.

Cordyceps sinensis polysaccharides; antioxidants; purification; monosaccharide composition

S567.3+5

A

2095-0934（2015）04-237-06

十二五国家科技支撑项目课题“食用菌深加工产品开发与产业化”（2013BAD16B07）

*为通讯作者，E-mail: sun_pl@zjut.edu.cn