杨泽华，杨长水，韦建华，卢汝梅（.广西中医药大学，广西 南宁　53000；.扬州大学医学院，江苏 扬州　5009）

荔枝草提取物的体外抗菌活性研究

杨泽华1，杨长水2，韦建华1，卢汝梅1
（1.广西中医药大学，广西 南宁530001；2.扬州大学医学院，江苏 扬州225009）

摘要：［目的］研究荔枝草提取物的体外抗菌活性。［方法］采用试管稀释法，测定了荔枝草提取物对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的最低抑菌浓度（MIC）。采用纸片扩散法测定荔枝草中部分化学成分的抑菌圈直径。［结果］荔枝草乙酸乙酯部位和正丁醇部位对受试菌株的MIC可低至3.1 mg/ml，具有明显抑菌作用；荔枝草中齐墩果酸和2α，3β-二羟基-12-烯-28-乌苏酸对革兰氏阳性菌有明显抑菌效果。［结论］荔枝草抗菌作用的活性部位是乙酸乙酯部位和正丁醇部位；齐墩果酸和2α，3β-二羟基-12-烯-28-乌苏酸是荔枝草抗菌作用的主要活性成分。

关键词：荔枝草；齐墩果酸；2α，3β-二羟基-12-烯-28-乌苏酸；抗菌活性

荔枝草（Salvia plebeia R.Br.）又名蛤蟆草、雪见草、皱皮草等，为唇形科鼠尾草属植物，全草入药。广泛分布于除西北以外的全国各地，野生资源极为丰富。荔枝草始载于《本草纲目》，具有清热解毒、凉血止血、利尿作用［1］。现代药理研究表明，荔枝草具有抗动脉粥样硬化、镇静、止咳化痰、抗组胺和抗氧化作用［2-5］，此外还有明显的抗菌抗炎作用，可抑制和杀伤多种细菌、病毒，有利于清除体内抗原，减少免疫复合物的形成［6］。笔者前期从荔枝草中分离鉴定了齐墩果酸、高车前素、2α，3β，24-三羟基-12-烯-28-齐墩果酸、3，4-二羟基苯甲酸、2α，3β-二羟基-12-烯-28-乌苏酸、2α，3β-二羟基-12-烯-28-齐墩果酸、高车前苷、假荆芥属苷等化合物［7］。在此基础上，本文对荔枝草不同提取物和单体化合物的体外抗菌活性进行初步研究，以明确其有效部位和有效成分，为深入探讨其物质基础和作用机制研究提供依据。

1　实验材料

1.1试药荔枝草采于广西大明山，经广西中医药大学刘寿养副教授鉴定为唇形科植物荔枝草Salvia plebeia R.Br.。荔枝草用乙醇回流提取，回收乙醇得乙醇总提取物，乙醇总提取物用系统溶剂分离法分离得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位的浸膏，单体化合物提取参考文献［7］的方法，临用前以生理盐水溶解，无菌过滤后备用。

1.2试剂所用溶剂均为分析纯（上海化学试剂有限公司生产）；0.9%氯化钠注射液（广西南宁百会药业集团有限公司产品）；医用蒸馏水；营养琼脂（国药集团化学试剂有限公司产品）；DMSO（天津汇英化学试剂有限公司提供）；0.2%氧氟沙星注射液（江苏扬州中宝制药有限公司）；营养琼脂（国药集团化学试剂有限公司产品）。

1.3试验菌株金黄色葡萄球菌ATCC35923，表皮葡萄球菌ATCC12228，大肠杆菌ATCC25922，绿脓杆菌ATCC27853均购自中国药品生物制品检定所，由广西中医药大学微生物与免疫学教研室保存提供。

1.4仪器DLF560型超净工作台（荷兰clear Air Techniek bv公司）；YXO-8G41.208压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业公司）；AG135型电子天平（瑞士产）；HHB11.500电热恒温培养箱（中国上海医疗器械七厂）；一次性使用无菌注射器（规格:1 ml，2 ml，5 ml；浙江京环医疗有限公司）。

2　方法

2.1琼脂稀释法［8-10］取保存的实验菌株接种于琼脂平皿培养基上，在37℃条件下孵育24 h后，挑取典型的单个菌落，转接种于肉汤培养基中，37℃继续孵育18 h，得到的菌液作为实验菌液备用。分别称取荔枝草乙醇总提取物及石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位浸膏各1.0 g溶于20 ml 0.9%氯化钠注射液中，不易溶于水的可先用二甲基亚砜（DMSO）溶解后再加水定容，DMSO含量小于0.5%（V/V），分别制备得到浓度为50 mg/ml的受试药液。将各提取物溶液倍比稀释成 8个不同浓度（50，25，12.5，6.3，3.1，1.6，0.8，0.4 mg/ml），分别吸取各提取物原液和稀释液与已融化并冷却至40℃左右的普通琼脂培养基均匀混合，制成不同含药浓度的平板培养基（厚度约为4 mm），编号为1～8。另外以含0.5% DMSO的培养基和不加药液的培养基作为空白对照实验，编号为9～10。用定量接种环取试验液，在无菌条件下分别接种于不同浓度的各含药培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养18 h。

2.2纸片法［11-12］将从荔枝草中分离得到的单体化合物齐墩果酸（Ⅰ），2α，3β-二羟基-12-烯-28-乌苏酸（Ⅱ），高车前苷（Ⅲ），假荆芥属苷（Ⅳ），用丙酮配成25 μg/ml浓度的样品溶液，选用直径为6mm的灭菌滤纸片，以氧氟沙星药敏片（浓度为25 μg/ml）作为阳性对照，生理盐水浸润的滤纸片作为阴性对照。用灭菌镊子夹起每张滤纸片，蘸取药液至布满滤纸片，待溶剂挥发后，将已点样的滤纸圆片贴于已涂布上述各菌悬液100 μl（菌液浓度106～107cfu/ml）的琼脂培养基上，放入25℃的培养箱中培养24 h。第2天测量其抑菌圈的直径大小。

3　结果与分析

3.1提取物的最低抑菌浓度（MIC） 检查整个实验过程中检测菌的存活状态，以能肉眼可见菌落生长被完全抑制的最低药物浓度为该药对检测菌的MIC。单一菌生长可忽略不计。荔枝草总提取物和石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位提取物对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的MIC测定结果见表1。

表1　荔枝草提取物对4株试验菌的最低抑菌浓度（mg/ml）

由表1可知，除水部位提取物外，荔枝草其它提取物对4株试验菌均有一定的抑菌作用，其中石油醚部位抑菌作用最弱，乙酸乙酯部位和正丁醇部位抑菌作用最强，乙酸乙酯部位和正丁醇部位均能显著抑制金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等革兰氏阳性菌的生长，MIC可低至3.1 mg/ml。

3.2化合物的抑菌圈测定化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ对4株试验菌的抑菌圈测定结果见表2。抑菌程度常用敏感度来表示，判断标准:抑菌圈直径大于15 mm为高度敏感，10～15 mm为中度敏感，7～9 mm为低度敏感，无抑菌圈表示无抑菌作用（—）。

表2　荔枝草中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ对4株试验菌的抑菌圈直径（mm）

从表2可知，阳性对照药氧氟沙星对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌的抑菌圈直径均＞15 mm，具有高度敏感；对大肠杆菌的抑菌圈直径为14.1 mm，属中度敏感；化合物Ⅰ、Ⅱ对金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌两种革兰氏阳性菌有显著抑制作用，抑菌圈直径分别为14.7、15.2 mm及16.4、17.5 mm；化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ对上述四种菌均有显著抑制作用，抑菌圈直径为11.5～17.5 mm，均为中度敏感以上；且4种化合物对所测试的革兰氏阴性菌的抑菌圈直径均小于14 mm，整体抑菌作用弱于对革兰氏阳性菌的作用。

4　结论

通过体外抑菌试验结果表明，荔枝草乙醇总提取物及各部位提取物在体外对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌均表现出一定的抗菌活性，其中乙酸乙酯部位和正丁醇部位对金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌有良好的抑制作用，而其它部位对该类菌的抑菌作用相对较弱。结果表明荔枝草抗菌活性部位主要是中等偏大的极性部位。

从荔枝草中分离得到的齐墩果酸（Ⅰ）和2α，3β-二羟基-12-烯-28-乌苏酸（Ⅱ）对革兰氏阳性菌有显著抑制作用，说明该类成分是荔枝草抑制革兰氏阳性菌有效成分之一。高车前苷（Ⅲ）和假荆芥属苷（Ⅳ）2种黄酮类成分对革兰氏阳性菌作用弱于齐墩果酸和2α，3β-二羟基-12-烯-28-乌苏酸，而对革兰氏阴性菌抑菌作用强于后者，这提示不同结构的化合物其抑菌谱可能存在差异，值得进一步深入研究。

参考文献

［1］全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编（上册）［M］.北京:人民卫生出版社，1982:153-154.

［2］孙启文，吴松，柳航，等.荔枝草的化学成分及药理作用研究新进展［J］.中国药师，2014，17（3）:481-483.

［3］刘旭杰，李玲，郝海鸥.荔枝草的祛痰及抗组胺作用［J］.第四军医大学学报，2003，24（19）:1776.

［4］翁新楚，谷利伟，董新伟，等.荔枝草化学成分的分离和结构鉴定及其抗氧化性能的研究［J］.烟台大学学报:自然科学与工程版，1997，10（4）:305-312.

［5］Jiang A L，Wang C H.Antioxidant properties of natural com. p.onents from Salvia plebeia on oxidative stability of ascidian oil［J］.Process Biochemistry，2006，41（5）:1111-1116.

［6］黄庆，方芸.复方荔枝草颗粒体内外抗菌消炎作用研究［J］.中国药房，2008，19（9）:657-658.

［7］卢汝梅，杨长水，韦建华.荔枝草化学成分的研究［J］.中草药，2011，42（5）:859-862.

［8］程丽娟，薛泉宏.微生物学实验技术［M］.西安:世界图书出版公司，2000:56-58.

［9］袁剑刚，刘昕，汤展球.橄榄的抑菌效应及其药效成分的初步研究［J］.食品科学，2001，22（3）:82-84.

［10］闫继平，王立波，李维，等.金荞麦抗菌活性研究［J］.中国现代中药，2006，8（6）:21-23.

［11］卢成英，徐东翔，杜勇，等.木叶抑菌活性成分提取分离与检测［J］.中成药，2006，28（1）:132-134.

［12］刘欣，郝淑贤，赵力超，等.荸荠英抑菌成分活性跟踪方法的研究［J］.食品科学，2005，26（7）:78-81.

（编辑陈明伟）

中图分类号：R284.1

文献标识码：A

文章编号：2095-4441（2015）02-0065-03

收稿日期:2015-02-20

通信作者:卢汝梅，E-mail:lrm1969@163.com

Study on Antibacterial Activity in vitro of Extract from Salvia plebeia

YANG Ze-hua1，YANG Chang-shui2，WEI Jian-hua1，LU Ru-mei1

（1.Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi，530001；2.College of Medicine，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu，225009）

Abstract:［Objective］To study on the antibacterial activity in vitro of extract of Salvia plebeia R.Br.［Methods］Tube dilution method was used to determine the minimal inhibitory concentration（MIC）of extract from Salvia plebeian on staphylococcus aur-eus，staphylococcus，Escherichia oli，pseudomonas aeruginosa.Disc diffusion method was used to determine antibacterial circle diameter of partial chemical composition in Salvia plebeia R.Br.［Results］The MIC of Salvia ethyl acetate and n-butanol fraction on tested strains could be as low as 3.1 mg/ml，which showed significant bacteria-inhibitory effect；oleanic acid and 2α，3β-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid in Salvia plebeia had significant bacteria-inhibitory effect on gram-positive bacterium.［Conclusion］The antibacterial active sites of Salvia plebeia are ethyl acetate and n-butanol fraction.The main antibacterial active ingredients of Salvia plebeia are oleanic acid and 2α，3β-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid.

Keywords:Salvia plebeia R.Br.；oleanic acid；2α，3β-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid；antibacterial activity