孙义杰，丛 霞，李华涛，国晓瞳，陈健伟，赵 园，姜忠玲，王 新，曹荣峰，田文儒

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109）

小檗碱俗名黄连素，属于清热解毒药，被认为是黄连中药理活性的主要物质基础[1]。Freile等[2]报道，小檗碱能有效抑制体外培养的金黄色葡萄球菌，也能强烈抑制由人体分离出的多种病原真菌和白色念珠菌。但关于小檗碱在兽医临床治疗领域中报道很少，本试验主要通过小檗碱以及青霉素、链霉素两种抗生素对人工诱导的兔乳房炎进行临床治疗，测外周血白细胞总数、炎性因子（TNF-α，IL-6）数量。对小檗碱治疗兔乳房炎作用的研究，可以避免使用抗生素治疗产生的耐药性以及容易复发的弊端[3]。

1 材料与方法

1.1 试验动物及病料 体重3～4 kg的健康妊娠家兔16只，从青岛某兔场采集的病兔乳房炎组织样用于细菌培养的棉拭子20份。TNF-α、IL-6 Elisa试剂盒（兔子）和盐酸小檗碱，购自北京北纳创联生物技术研究院；青霉素，购自山东恒信兽药批发部；硫酸链霉素，购自山东中牧兽药有限公司。

1.2 金黄色葡萄球菌的分离及培养 将采集的病兔乳房组织棉拭子划线涂于分离培养基中，放入温箱培养24 h后，取单个菌落接种于肉汤培养基，培养箱培养24 h后，取100μL金黄色葡萄球菌接种于肉汤培养基（100 mL），摇床6～8 h，进行金黄色葡萄球菌的复苏。然后用754型紫外可见分光光度计在600 nm下选择OD值在0.08～0.1的菌液，浓度为108CFU/mL，用于人工造兔乳房炎模型。

1.3 抑菌效率测验 将金黄色葡萄球菌接种于普通琼脂培养基，37℃培养24 h后，挑取4～5个直径大约为1 mm的菌落，溶于1 mL的蒸馏水中，分别取0.1 mL上述菌液于含青霉素及小檗碱的营养肉汤培养基中，分别在37℃培养0、4、14、30 h和48 h时各取出5 mL的培养物，用营养肉汤稀释100倍后，再分别取出0.1 ml接种于青霉素（青霉素浓度为0.064 IU/mL）和小檗碱1（0.125 mg/mL）和小檗碱2（0.25 mg/mL）的肉汤培养基中培养，在培养的0、4、14、30、48 h后各取出培养物接种于琼脂培养基，在37℃恒温培养箱中培养24 h后计菌落数（CFU）[4]。

1.4 扫描电镜观察 分别向对数期生长的细菌培养液中加入小檗碱溶液（0.5 mg/mL）、青霉素溶液（40 IU）和链霉素溶液（30μg），作用2 h后离心，将沉淀物用2.5%戊二醛固定，再用梯度乙醇脱水，干燥、离子溅射金后，用扫描电镜观察。

1.5 试验模型的建立、分组及治疗 16只体重3～4 kg生长状况良好的产仔后7 d泌乳正常的母兔，通过乳腺注射104CFU/mL的金黄色葡萄球菌悬液1 mL，诱使乳腺发炎。随机分组为A（对照）组、B（小檗碱）组、C（青霉素）组和D（链霉素）组。5 h后分别给兔注射0.8 mL生理盐水（对照组），0.8 mL浓度为1.875 mg/mL的小檗碱（小檗碱组），0.8 mL含有16万IU的青霉素（青霉素组），0.8 mL含有10万μg的链霉素（链霉素组）。

1.6 检测指标的测定 在造模前1 h、造模后4、8、12、24 h和36 h分别采四组兔的血液0.5 mL、血清1 mL，进行外周血白细胞总数以及TNF-α和IL-6测定。

1.7 数据处理 试验数据以平均数士标准差（X±S）表示，采用SPSS软件13.0版进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 细菌计数 在青霉素作用0、4 h和14 h时后，金黄色葡萄球菌的数量在逐渐减少，但是在作用30 h后，细菌数量开始增多，表明金黄色葡萄球菌对青霉素产生了耐药性；而在小檗碱作用后的0、4、14、30、48 h时，金黄色葡萄球菌的数量直线减少，随浓度的升高抑菌效果更明显（图1），且细菌对其未产生耐药性。

图1 青霉素和小檗碱作用不同时间后金黄色葡萄球菌的细菌计数（CFU）

2.2 药物作用后细菌的形态变化 扫描电镜下，正常金黄色葡萄球菌呈葡萄串状，排列紧凑，菌体表面光滑，细胞形态饱满（图2，A）。小檗碱作用2 h后，金黄色葡萄球菌之间联接松散，菌体大小不一，表面变得粗糙并有凸起物(图2，B中箭头)。青霉素作用2 h后，金黄色葡萄球菌连接松散，菌体皱缩、破裂（图2，C中箭头）。链霉素作用2 h后，金黄色葡萄球菌连接松散，有极少数菌体破裂（图2，D中箭头）。

2.3 受试兔白细胞总数 造模后8 h，对照组和链霉素组兔白细胞总数显著（P＜0.05）高于青霉素组；在造模后8～12 h，青霉素组极显著（P＜0.01）高于小檗碱组；造模后12～36 h，对照组和链霉素组兔白细胞总数极显著（P＜0.01）高于小檗碱组和青霉素组；在造模后8～24 h，对照组和链霉素组无显著性差异；在造模后24～36 h，青霉素组和小檗碱组无显著性差异（表1）。

表1 4组兔造模前后白细胞总数 （×109/L）

图2 扫描电镜下金黄色葡萄球菌（正常，A）在小檗碱（B）、青霉素（C）和链霉素（D）作用2h后的变化

2.4 受试兔TNF-α和IL-6的含量 在造模后8 h，小檗碱组兔TNF-α的含量极显著（P＜0.01）高于青霉素组；在造模后12 h，青霉素组显著（P＜0.05）高于小檗碱组；在造模后36 h，青霉素组极显著（P＜0.01）高于小檗碱组；在造模后8～36 h，对照组和链霉素组极显著（P＜0.01）高于小檗碱组和青霉素组，对照组和链霉素组无显著性差异。

在造模后12 h，小檗碱组兔IL-6的含量极显著（P＜0.01）高于青霉素组；在造模后24 h，青霉素组和链霉素组显著（P＜0.05）高于小檗碱组；在造模后36 h，小檗碱组、青霉素组、链霉素组无显著性差异；在造模后12～36 h，对照组极显著（P＜0.01）高于小檗碱组、青霉素组、链霉素组（表2和表3）。

表2 四组兔造模前后TNF-α的含量 （pg/mL）

3 讨论

细菌耐药性的形成与扩散已成为抗感染化疗面临的一个严重的问题，特别是对多种抗生素具有耐药性的多重耐药菌株的形成和日益增多尤使人们深感忧虑。本试验通过小檗碱与青霉素在体外抑菌试验中对比，得出小檗碱对金黄色葡萄球菌有非常好的抑制效果，对金黄色葡萄球菌的抑制时间更长久，且不会随着时间延长而产生明显的耐药性。小檗碱浓度越高，对金黄色葡萄球菌的抑制效果越好。

表3 四组兔造模前后IL-6的含量 （pg/mL）

本试验电镜下对比小檗碱和青、链霉素对金黄色葡萄球菌的作用，小檗碱处理过的菌体大小不一，且表面凹凸不平，青、链霉素处理的菌体有的破裂，没有破裂的大多维持原来的细菌形态。可能是由于小檗碱改变了细胞壁的通透性、水分进入细菌，使其体积增大，同时发生酶外漏[5]，并在细胞表面聚集。Yi等[6]采用9种有明确抗菌机制的药物作为对照，用HPLC/ESI-MS技术和主因分析法研究发现，利福平和诺氟沙星的抗菌机制与小檗碱十分相似，进而推断小檗碱抑菌时可能以核酸作为作用靶位。此外，用小檗碱处理时间越长，金黄色葡萄球菌表面凸起物越多，菌体皱缩越严重，说明小檗碱的抑菌见效慢，需要作用时间长。

目前，在临床上有关用小檗碱治疗兔乳房炎的报道较少，本试验表明，在治疗临床型兔乳房炎过程中，无论从临床症状改善方面还是从血常规的变化上，小檗碱都有明显的治疗效果，虽然青霉素起效最快，但在血液中维持的时间较短[7]，且后期药效降低。小檗碱虽然起效慢于青霉素，但在整个治疗过程中，小檗碱治疗效果稳定，且疗效更持久。因为从金黄色葡萄球菌的形态变化可推断，小檗碱与青霉素的抗菌机制不同。当然，小檗碱在临床上用于治疗兔临床型乳房炎的效果还需进一步探讨，因为小檗碱是否对由其他细菌引起的兔乳房炎有效，是否与其他中药有效成分或抗生素合用治疗效果更好，以及其抑菌机制如何等，都需要进一步研究。

[1]焦利萍.中草药治疗乳痈初期疗效观察[J].中国现代医药杂志，2007，9（7）：18-19.

[2] Freile M L，Giannini F，Pucci G，et al.Antimicrobial activity of aqueous extracts and of berberine isolated from Berberis hetero⁃phylla[J].Fitoterapia，2003，74（7-8）：702-705.

[3]李华，刘宏娟，尹秀生.抗生素使用存在的问题及分析[J].兽医卫生，2009，9：38.

[4]朱以勇，王和.抗生素对耐药菌生长繁殖影响的观察[J].中国微生态学杂志，2002，14（4）：207-208.

[5]刘体全，郝勇，陈兴.氮酮抑菌机理的研究[J].中国消毒学杂志，1998，15（1）：15.

[6]Yi Z B，Yu Y，Liang Y Z，et al.Evaluation of the antimicrobial mode of berberine by LC/ESI-MS combined with principal compo⁃nent analysis[J].JPharm.Biomed Anal，2007，44：301-304.

[7]张秀英，丛霞，王新.酸性药物对兔体内青霉素G钠药动学及组织分布的影响[J].中国兽医杂志，2000，26（7）：58-59.