刘博奇，陈善真，陈克宏，罗 均，王志花，王贵平，李其昌

（广东海大畜牧兽医研究院，广东 广州 511400）

猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）是由PRRSV直接引发的一种高度接触性传染病，其重要流行特征为持续性感染，呈地方流行性。2007年4月，农业部颁布《高致病性猪蓝耳病防治技术规范》开始将高致病性蓝耳病纳入国家重大动物疫病政府强制性免疫范围。PRRSV的防治和净化需要安全高效的疫苗以及相关检测技术的配合使用，因此随着对蓝耳病研究的深入，研制更为精确的抗原用作蓝耳病疫苗及相关免疫诊断试剂越来越被重视。

本试验利用已筛选的PRRSV偶联多肽为抗原，建立了具有高特异性和敏感度的ELISA方法，为临床猪血清样品蓝耳病抗体检测提供了科学有效的快速检测手段。

1 材料与方法

1.1 试剂 3，5′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）、聚葡糖糖胺、EDC均为Sigma公司产品；羊抗猪IgGHRP为美国KPL公司产品；PRRS阳性高免血清由广东永顺生物制药有限公司馈赠；PRRS阴性血清由广东某实验动物中心提供。

1.2 多肽的筛选、合成、偶联 参考已发表文献，应用生物信息学方法对PRRSV ORF3蛋白的抗原表位进行预测，确认其抗原决定簇（epitopes）筛选出1条针对美洲型抗体位点的PRRS基因序列，由生物公司进行多肽合成及纯化。取已合成纯化的多肽10 mg溶于50μL DMSO，加入10 mL双蒸水；称取1 mg聚葡糖糖胺溶于1 mL PBS中，于多糖溶液内加入10 mg EDC偶联剂，混匀，最后与多肽溶液混合，室温下搅拌反正3 h。使用透析袋（MWCO10000-12000）透析6～8 h，除去未结合的偶联剂及游离多肽，将透析后的液体纯化、冻干即得偶联多肽。

1.3 ELISA操作方法 偶联多肽用碳酸盐缓冲溶液稀释并包被96孔酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜。次日取出用PBST洗涤3次，拍干；每孔加入150 μL封闭液，37℃封闭1 h，PBST洗涤3次，拍干，4℃保存备用；用抗体稀释液稀释待检测血清样品及阴、阳性血清，室温孵育30 min，PBST洗涤6次，拍干；100μL/孔加入用HRP稳定液1∶4000稀释的羊抗猪IgG-HRP，室温孵育30 min，PBST洗涤6次，拍干；每孔加入100μL TMB底物显色液，室温避光显色10min后加入50μL/孔终止液终止反应，于酶标仪测定其OD450nm值。血清样本抗体效价（S/P）=（OD450nm样品-OD450nm阴性）/（OD450nm阳性-OD450nm阴性），根据其S/P值确定每份样品的抗体效价，待测样品效价大于临界值的判定为阳性，小于临界值的判定为阴性。

1.4 ELISA最佳工作条件的确定 以0.125～1μg/mL的偶联多肽作为抗原包被酶标板，将PRRS阴、阳性血清分别按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80进行稀释，羊抗猪IgG-HRP二抗做1∶2000、1∶4000、1∶6000、1∶8000四个稀释度，进行ELISA反应条件优化；分别将阳性和阴性OD450nm值记为S、N，计算S/N值，取S/N值最大且阳性血清OD450nm值接近1.0时各样品稀释度为最佳，用以确定抗原浓度、血清稀释度及HRP的最佳工作浓度。

1.5 阴阳性临界值的确定 用建立的ELISA方法检测临床采集的70份猪蓝耳病阴性血清样品，计算其平均OD450nm值（-X）和标准方差（SD）；根据统计学原则，样本OD450nm值≥（-X）+2SD时，即可在99.9%的水平上判定为阳性。

1.6 特异性试验 利用该方法对猪瘟病毒（HCV）、圆环病毒2型（PCV-2）、O型口蹄疫病毒（FMDV）和猪伪狂犬病病毒（PRV）等猪阳性血清样品进行检测，观察该方法的特异性。

1.7 敏感性试验 用自建ELISA方法检测已按1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000系列稀释的阳性样品，每个样品做2个重复孔，并用美国IDEXX猪蓝耳病抗体检测试剂盒做对比参照，用来鉴定该方法的敏感度。

1.8 符合率试验 用自建ELISA方法对160份已知阴、阳性血清（阴、阳性血清各80份）进行检测，并与美国IDEXX猪蓝耳病抗体检测试剂盒的检测结果进行对比分析，计算二者的符合率。

2 结果与分析

2.1 ELISA最佳工作条件 由方阵ELISA测定结果取S/N最大、且阳性血清OD450nm值接近1.0时的浓度为最佳，结果见表1。合成肽抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL，血清最佳稀释度为1∶40，HRP最佳稀释度为1∶4000。

表1 ELIS A最佳工作条件 （S/N）

2.2 阴、阳性判定的临界值 对70份阴性猪血清样本进行检测，结果见表2。计算其平均OD450nm值（-X）为0.1172，标准方差（SD）为0.0665，计算阴、阳性血清临界值为-X+2SD=0.2502，因此将0.25判定为血清阴、阳性的界限，即根据血清样本S/P=（OD450nm值样品-OD450nm值阴性）/（OD450nm值阳性-OD450nm值阴性）确定每份样本的抗体效价，当S/P≥0.25时判定为抗体阳性，S/P＜0.25时判定为抗体阴性。

2.3 特异性试验结果 用自建ELISA方法对猪瘟病毒（HCV）、圆环病毒2型（PCV-2）、O型口蹄疫病毒（FMDV）和猪伪狂犬病病毒（PRV）等猪阳性血清样品进行检测，每个样品重复3个孔，由表3结果可见HCV、PCV-2、FMDV、PRV等阳性血清均不与PRRS多肽抗原发生反应，表明已筛选出的PRRS多肽抗原具有良好的特异性。

表2 阴性血清样本的OD值

表3 特异性试验结果

2.4 敏感性试验结果 用自建ELISA方法对1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000系列稀释的阳性血清样品进行检测，每个样品做2个重复孔，并用美国IDEXX猪蓝耳病抗体检测试剂盒做对比参照，见表4结果可知，阳性血清稀释度为1∶1000时仍可检测出PRRS抗体阳性，表明本抗体检测试剂盒的最低检测限量为1∶1000，同时用IDEXX试剂盒在阳性血清稀释度为1∶1000时检测PRRS抗体亦为阳性。

表4 敏感性试验结果

2.5 符合试验结果 用自建ELISA方法分别对已知的阴、阳性血清各80份进行检测并与IDEXX检测结果进行对比：IDEXX检测血清呈阳性为80份、阴性80份，与已知阴、阳性结果相符；自建多肽检测血清呈阳性为84份、阴性76份，其中与IDEXX同为阳性73份、阴性69份，假阳性11份、假阴性7份。二者的总体符合率为88.75%。

3 讨论

近年来伴随着政府对于扶持养猪业出台的一系列政策，规模化猪场的数量也越来越多，对高致病性蓝耳病的防治尤为关键，在做好计划免疫的同时，也要定期对猪群进行PRRSV抗体检测，以便及时了解猪蓝耳病的活跃情况及免疫情况。目前对于PRRSV抗体的检测有多种方法，其中，ELISA方法具有操作简便、快速、敏感且标准化，尤其适合用于疫病检测和流行病学调查研究，因此被广泛用于临床血清学抗体的检测。由于国内常见的猪蓝耳病多为美洲型，因此本试验中，我们通过多肽筛选，最终合成了一条针对美洲型抗体位点的特异性多肽序列，通过偶联技术将多肽偶联后作为抗原包被酶标板，经过一系列试验优化后确定其最佳的抗原包被浓度、一抗及二抗的稀释度等条件。本试验对酶标板的选取、ELISA封闭液、抗体稀释液和底物液的配制均进行了长时间的摸索和研究，使之不仅最大程度的降低了非特异性干扰反应，也保证了其试剂的稳定性；建立的ELISA方法具有很好的检测敏感度及特异性，与美国IDEXX猪蓝耳病抗体试剂盒的符合率试验可达88.75%。由于进口试剂盒价格昂贵，而通过此方法为转化一种经济、敏感、稳定的应用试剂盒打下了重要基础。

表5 符合率试验结果

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