樊桂芳

（青海湟中县上新庄镇经济发展服务中心，811600）

青海省6种白粉菌的形态记述及rDNA-ITS系统发育分析

樊桂芳

（青海湟中县上新庄镇经济发展服务中心，811600）

对采自青海省的6种白粉菌进行了形态学分类鉴定，并对这几种rDNA-ITS序列进行扩增和测序，构建了系统发育树，分析了这几种白粉病菌的种类和彼此之间的系统发育关系。研究证明，形态分类学结果与分子系统发育结果一致，也证实国际白粉菌分类理论与方法的合理性。

白粉菌；形态；系统发育；青海省

白粉菌是一类广泛分布世界各地的植物病原真菌，隶属子囊菌门Ascomycota、锤舌菌纲Leotiomycetes白粉菌科Erysiphaceae，是子囊菌中很独特的一类，其极易流行，严重影响植株的生物学产量及质量[1~3]。青海具有特殊的地理位置，地处青藏高原东北部，地形多为盆地、高山和河谷相间分布的高原，海拔较高、降雨量少、昼夜温差大、日照时间长、气候冷凉[4]，有关青海省的白粉菌研究报道很少，因此，对青海白粉菌进行研究，不仅为该林区菌物及物种多样性研究提供基础资料，也为开展白粉菌生态学研究及白粉病防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2014年8~9月，在西宁市、乐都、和诺木洪农场分别采集了白粉菌标本，将标本完全压干后分装于标本袋中保存。

1.2 试验方法

从标本刮取其分生孢子、闭囊果进行光学显微镜（OLYMPUS-CX31RTSF）观察、形态描述和大小测定。

①分子系统发育DNA抽提。a.将菌丝体刮下置于1.5 mL离心管，充分研磨。

b.加600 μL CTAB提取液混匀，于60~65℃水浴中温育1~2 h。

c.加入等体积（600 μL）的Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)振荡器离心管混匀，12 000 r/min下离心10 min。

d.取上清液置于新离心管中，加等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）振荡器混匀，12 000 r/min下离心10 min。

e.取上清液，加入2倍体积的CTAB沉淀液、混匀，室温孵育20~30 min，室温12 000 r/min离心15 min。

f.弃上清液，加350 μL NaCl溶液（1.2 mol/L，DNA溶解液）溶解沉淀，然后加入350 μL氯仿，混匀30 s。

g.离心10 min（12 000 r/min），分层，将上清液移至一新的离心管中，加入0.6~0.8倍体积的异丙醇，混匀，室温静置30 min。

h.室温离心20 min（12 000 r/min），向沉淀加入500 μL 70%乙醇，混匀。

i.离心5 min（12 000 r/min），小心仔细倒入上清液，弃之。

j.重复步骤i，室温干燥后，将DNA溶于50 μL去离子无菌水中，于4℃保存备用。

②PCR扩增PCR扩增引物参考White等[5]，送上海生物工程有限公司合成。rDNA-ITS PCR引物序列ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

PCR扩增体系见表1。PCR反应程序：95℃预变性4 min，94℃变性1 min，54~60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃再延伸8 min；4℃保存。

③测序分析将PCR产物送至上海生工进行测序，测序结果在NCBI上进行BLAST同源性对比，找出最相似的序列。利用软件Mega 4.0构建系统发育树，并分析序列结构及序列间亲缘关系。

2 结果与分析

2.1 6种白粉菌形态记述

①穆氏节丝壳Arthrocladiella mougeotii(Lév.) Vassilkov,Bot.Mater.Otd.Sporov.Rast.Bot.Inst. Komarova Akad.Nauk S.S.S.R.:112,1963.

菌丝体多生于叶面，形成白色较厚的斑片，存留；分生孢子串生，桶柱形、椭圆卵形，（18~29）μm×（10~13）μm，子囊果散生，黑褐色，扁球形，直径123~155 μm；壁细胞不规则多角形，附属丝58~129根，生于赤道或子囊果上部，常相互交错缠结在一起，顶端2~3次双分叉或少数三分叉，个别附属丝在顶端膨大，上下等粗或基部稍粗，无色、光滑；子囊15~24个，长椭圆形、卵形，短柄，（50~71）μm×（18~25）μm；子囊孢子2个，椭圆形，（16~19）μm×（10~12）μm。

表1 PCR扩增体系

②钩状白粉菌Erysiphe aduncavar.adunca（Wallr.）Fr.Syst.Mycol.3:245,1829.

菌丝体叶面生，形成厚的白色斑片，铺满整个叶片；分生孢子单生，桶柱形或椭圆形，（20~35）μm×（7.5~10.0）μm；闭囊果散生至聚生，暗褐色扁球形，直径90~172.5 μm，壁细胞不规则多角形，直径5~ 20 μm；附属丝15~100根，直或弯曲，个别近曲膝状，长50.0~182.5 μm，长度为闭囊果直径的0.5~1.3倍，基部宽5~10 μm，上下近等粗或向上渐粗，壁薄光滑、无色，大多无隔膜仅个别基部有1隔膜，顶端简单钩状1.0~1.5圈，少数卷曲2圈，顶端钩状部分膨大；子囊6~12个，卵形、广卵形、不规则卵形或近球形，有柄或少数无柄，（40.0~72.5）μm×（30~55）μm；子囊孢子3~6个，淡黄色，矩圆形、卵形或长卵形，（17.5~32.5）μm×（10~15）μm。

③豌豆白粉菌Erysiphe pisiDC.,Flore fran-觭aise 2:174,1805.

菌丝体叶两面生，在叶面形成白色斑片，分生孢子单生，桶柱形或近柱形，（16~32）μm×（9~16）μm；闭囊果散生至近聚生，暗褐色扁球形，直径73~ 117 μm，壁细胞不规则多角形；附属丝12~16根，大多不分枝，少数不规则的分枝1~2次曲折状至波状，部分曲膝状，长41~420 μm，上下近等粗或局部粗细不均，宽2~6 μm，壁薄，平滑或基部稍粗糙，有0~2个隔膜，全长褐色、淡褐色或基部褐色而向上近无色；子囊3~10个，卵形、不规则卵形或其他不规则形状，多数有短柄少数近无柄，（39~74）μm×（22~45）μm；子囊孢子4~6个，卵形、矩圆卵形，淡黄色，（15~33）μm×（10~15）μm。

④蓼白粉菌Erysiphe polygoniDC.,Flore fran-觭aise 2:614,1805.

菌丝体叶两面生，在叶面形成很厚的白色斑片，存留；分生孢子单生，桶柱形、柱形，（24~55）μm×（10~17）μm；闭囊果近聚生至聚生，暗褐色扁球形，直径96~122 μm，壁细胞不规则多角形；附属丝9~ 26根，不分枝或不规则分枝分枝1~2次，弯曲或曲折状，长26~130 μm，上下近等粗或局部粗细不均，宽2.0~5.5 μm，壁薄，光滑或略粗糙，有0~2隔膜，基部褐色向上逐渐变淡至无色；子囊4~6个，不规则卵形、长卵形，有柄或无柄，（49~65）μm×（28~46）μm；子囊孢子2~4个，椭圆形或卵矩圆形，黄色，（20~ 30）μm×（10~15）μm。

⑤苍耳单囊白粉菌Podosphaera xanthii（Castagne）Braun&Shishkoff,in Braun&Takam., Schlecht.4:31,2000.

菌丝体叶两面生，在叶面居多，形成白色斑片；分生孢子串生，柱形、桶形，（20~33）μm×（10~18）μm；闭囊果散生，暗褐色扁球形，直径77~113 μm，壁细胞较大，不规则多角形；附属丝4~10根，生于闭囊果的下部，弯曲或曲膝状，常与菌丝体缠绕，长35~ 525 μm，壁薄，光滑或稍粗糙，上下近等粗或局部粗细不均，宽4~8 μm，有0~3个隔膜，全长褐色不分枝；子囊1个，卵形、近球形，无柄，（52~87）μm×（43~70）μm；子囊孢子6~8个，椭圆形或卵形，（16~ 25）μm×（10~15）μm。

⑥芍药白粉菌Erysiphe paeoniaeR.Y.Zheng &G.Q.Chen,Sydowia 34:300,1981.

菌丝体叶两面生，叶面为主，亦生于叶柄，在最后铺满全叶，消失或近存留，分生孢子单生，椭圆形、柱形，（22.5~40.0）μm×（7.5~12.5）μm；闭囊果散生，暗褐色、扁球形，直径80~110 μm；壁细胞不规则多角形，直径5~20 μm；附属丝15~32根，弯弯曲曲形状极不规则，枯枝状，大部分不规则分枝多次，少数突状小分枝，长60~155 μm，长度为闭囊果直径的0.7~1.3倍，粗细不均，基部宽5.0~7.5 μm；壁薄且粗糙，无隔膜，全长褐色或基部淡褐色向上逐渐变淡至无色；子囊4~6个，卵形、近球形、或其他不规则形状，具短柄或无柄，（47.5~70.0）μm×（30~45）μm；子囊孢子3~6个，黄色，卵形或椭圆形（17.5~25.0）μm×（10.0~12.5）μm。

2.2 分子系统发育分析

测序由上海生工进行，5种白粉菌的rDNA-ITS区段测序均测出，长度为394~462 bp，平均429 bp，平均GC含量53.2%。rDNA~ITS序列共544个位点，其中保守位点267个、变异位点194个、简约信息位点145个、自裔位点48个，变异位点和和信息位点分别占全序列的45.2%和33.8%。经BLAST同源性比较，验证所测序列是否为目的序列。将所有测出的目的序列和参比序列用ClustalX（version l.8）进行序列对准，删除缺失位点、残缺位点、非编码序列位点并用BioEdit人工调整后，利用MEGA4.0对rDNA序列进行多重比对分析，去除过短序列或混杂序列。

图1 NJ法构建rDNA-ITS系统发育树

采用邻近结合法（neighbor~joining,NJ）构建系统发育树，利用MEGA 4.0[6]软件选基于Kimura~2~ Parameter双参数模型，并对所构建的系统发育树进行自举分析（bootstrap，重复1 000次），以估算分枝的支持率。rDNA-ITS系统发育NJ树（图1）显示，参试的5种白粉菌与原种的相似度极高，自展值均在97以上，证明为同种，这个结果与形态学分类一致。钩状白粉菌Erysiphe aduncavar.、豌豆白粉菌Erysiphe pisiDC.、蓼白粉菌Erysiphe polygoni DC.聚在了一个大的类群下，为白粉菌属（Erysiphe），但是这3种白粉菌彼此的亲缘关系较远；穆氏节丝壳Arthrocladiella mougeotii单独成一个分枝，通过属间关系比较，发现其与高氏白粉菌属的亲缘关系较近，这个结果也符合最新的白粉菌分类系统；苍耳单囊白粉菌Podosphaera xanthii与单囊壳属的各种一起聚集在了单囊白粉菌属下。

3 结论与讨论

通过对青海省白粉菌的采集，共发现白粉菌6种，对这6种白粉菌做了详细地描述，并对这6种白粉菌的分子系统发育进行了研究。结果证明，形态学分类的结果与分子系统发育结果相一致，也证实了国际白粉菌分类理论与方法的合理性[7~10]。但这些菌仅是青海省常见的部分种，详细的种还需要全面调查研究。

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The Morphology of Six Powdery Mildew Account and rDNA ITS Phylogenetic Analysis in QingHai Province

FAN Guifang
(Economic Development Service Center in Shang Xinzhuang Town in Huangzhong county in Qinghai)

In this paper,we classified and identified six kinds of powdery mildew in Qinghai on morphological,and carried on rDNA-ITS amplification and sequencing experiments.Phylogenetic tree was constructed.We analyzed the several species phylogenetic relationship between each other.Studies showed that the results of morphological are consistent with subsystem development,and have confirmed the international theories and methods of classifition of powdery mildew are reasonable.

Powdery mildew;Form;System development;Qinghai

S436.421.1+2

A

1001-3547（2015）20-00100-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2015.20.038

樊桂芳（1984-），女，本科，助理工程师，从事林业技术推广工作，电话：13997004951，E-mail：770976898@qq.com

2015-08-21