李葱葱　李飞武　谭喜昌　夏蔚　邵改革　龙丽坤

摘要：利用生物信息学方法优化了适用于原核表达的Bar基因序列密码子，克隆了Bar基因序列并构建了pET28a-Bar融合表达载体，并转入大肠杆菌宿主菌BL21（DE3）。结果表明，融合表达载体在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中以包涵体形式表达膦丝菌素乙酰转移酶（PAT蛋白质），并通过镍离子亲和层析纯化后获得了PAT蛋白质，该纯化蛋白质的获得为利用酶联免疫法定量检测和筛选转基因植物提供了必要前提。

关键词：Bar基因；膦丝菌素乙酰转移酶；原核表达；分离纯化

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）10-2515-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.058

Bar基因作为筛选标记基因，具有快速、简便、高效、转化细胞产生的假阳性个体少等优点，被广泛应用于转基因玉米（Zea mays L.）、大豆（Glycine max）、油菜（Brassica campestris L.）、水稻（Oryza sativa L.）、小麦（Triticum aestivum Linn.）和大麦（Hordeum vulgare L.）植物基因工程研究中[1-3]。Bar基因编码膦丝菌素乙酰转移酶（PAT），其能够使草丁膦的有效成分——膦丝菌素（PPT）失活，从而解除除草剂的毒性。Bar基因广泛应用于基因工程育种中的抗除草剂基因，也是遗传转化中的标记基因[4]。目前，生物技术育种的阳性转化体筛选多数依据Bar基因表达的草丁膦除草剂耐受性进行表型鉴定筛选。而由于其不同时代单个转化体的外源基因表达稳定性未知，表型筛选易受环境等因素影响，导致了鉴定准确性不高。转基因植物标记基因的检测方法主要有表型鉴定、PCR鉴定、ELISA和Western印迹等方法[5]。ELISA分析法特异性高，获得结果快，仪器操作简单，同时可降低检测成本[6-8]。建立Bar基因原核表达体系，表达和纯化PAT蛋白质可为转基因转化外源蛋白质提供参考，本研究通过密码子优化和全基因合成，获得了适合原核表达的Bar基因片段，并分离纯化得到的高纯度PAT蛋白质，可作为抗原为制备多抗和单抗打下基础。……