金刚　陈涛　苏文潘　黄强　覃旭　吕平　覃剑峰　王春田

摘要：剑麻H.11648（Agave hybrid No.11648）是以蓝剑麻（A. amaniensis）和假菠萝麻（A. angustifolia）为亲本进行杂交，F1再与蓝剑麻回交选育而来。分析了剑麻H.11648及其两个亲本叶绿体psbA-trnH序列的差异。结果表明，剑麻H.11648与蓝剑麻的psbA-trnH存在1个明显的SNP差异，而在该位点与假菠萝麻保持一致，从叶绿体DNA水平证实了剑麻H.11648的细胞质来源于假菠萝麻。

关键词：剑麻H.11648（Agave hybrid No.11648）；蓝剑麻（A. amaniensis）；假菠萝麻（A. angustifolia）；psbA-trnH

中图分类号：S563 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）10-2513-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.057

剑麻（Agave sisalana Perr. ex Engelm.）是龙舌兰科（Agavaceae）所属单子叶植物的统称，也称为龙舌兰麻。该科有9属293种，大多原产于墨西哥一带，龙舌兰属是该科中最重要的一个属[1]。剑麻纤维具有色泽洁白、质地坚韧、富有弹性、拉力强、耐磨擦、耐酸碱、耐腐蚀、不易打滑等特点，已成为目前用量最大、范围最广的一种硬质纤维。由于剑麻的原产地不在中国，我国的剑麻种质资源比较匮乏，育种工作相对滞后，剑麻栽培品种单一化的问题相当严重[2]。目前，我国剑麻种植区的当家品种为H.11648，其种植面积占98%以上，其他栽培品种广西76416和番麻主要用于补植。剑麻H.11648是由东非坦桑尼亚剑麻试验站育成，该品种是以假菠萝麻（A. angustifolia）为母本、蓝剑麻（A. amaniensis）为父本进行杂交，获得有性杂种第一代（F1），再利用开花的F1作为亲本与蓝剑麻回交而获得有性杂种回交一代（BC1），通过系比、选择而育成[3-5]。但有些研究资料记载剑麻H.11648的杂交选育过程为（蓝剑麻×假菠萝麻）×蓝剑麻[6]。这一问题可以归结为剑麻H.11648的细胞质究竟来源于蓝剑麻还是假菠萝麻。

运用物种特异的DNA序列信息位点，能够给剑麻H.11648的细胞质来源提供可靠的科学依据。psbA-trnH片段是位于叶绿体基因组上psbA基因和trnH基因之间的一段非编码序列，长约300 bp，可用于植物属间及种间的系统发育研究。本研究基于剑麻叶绿体基因组的遗传信息，分析了剑麻H.11648、蓝剑麻和假菠萝麻psbA-trnH序列的差异，以期揭示剑麻H.11648的细胞质来源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 剑麻H.11648及其原始亲本假菠萝麻和蓝剑麻的新鲜幼嫩叶片均取自广西亚热带作物研究所龙舌兰麻种质资源圃。

1.1.2 生化试剂 Pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和dNTPs购自北京康为世纪生物科技有限公司；pUCm-T载体、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和大肠杆菌DH5α感受态细胞购自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR引物由华大基因公司合成。

1.2 方法

1.2.1 叶绿体psbA-trnH序列PCR扩增 采用改进的CTAB法提取剑麻总DNA[7]。psbA-trnH序列扩增的参考通用引物，trnH2R（GUG）：5′-GCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′；psbA：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′[8]。PCR反应采用20 μL扩增体系，包括DNA模板1.0 μL、10×PCR Buffer 2.0 μL、dNTPs（2.5 mmol/L） 2.0 μL、Primer F（2.5 μmol/L） 1.0 μL、Primer R（2.5 μmol/L） 1.0 μL、Pfu DNA聚合酶0.2 μL、超纯水12.8 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。

1.2.2 psbA-trnH序列测定 利用Pfu酶扩增3份材料的叶绿体psbA-trnH序列后，再向反应液里加入5 U的Taq DNA酶，混匀后置于72 ℃反应30 min，进行简易的加A反应。反应结束后，用1.1%的琼脂糖凝胶进行电泳分离。回收纯化目的片段后，连接至T载体后进行DH5α大肠杆菌感受态的转化并进行蓝白斑筛选，挑取白色阳性克隆交由华大基因公司测序。

1.2.3 多重比对 应用DNAman 6.0.3.99软件对剑麻H.11648、蓝剑麻和假菠萝麻的psbA-trnH序列进行多序列同源性分析，参数取原始默认值。

2 结果与分析

2.1 psbA-trnH序列的PCR扩增

利用psbA-trnH序列的通用引物，以剑麻H.11648、蓝剑麻和假菠萝麻的叶片总DNA为模板，进行PCR扩增，结果见图1。从图1中可以看出，从剑麻H.11648、蓝剑麻和假菠萝麻中均扩增出约700 bp的单一条带。

2.2 剑麻H.11648与其亲本psbA-trnH序列比较

多重比对结果表明，3份种质psbA-trnH序列的相似度很高，仅存在2个SNP位点。其中一个为蓝剑麻与另外2份种质的C/T差异。第二个SNP位点在假菠萝麻中出现，表现为1个胸腺嘧啶的缺失。由于该处出现连续的胸腺嘧啶，有可能是由于Pfu DNA聚合酶的不稳定扩增导致（图2）。因此，未将第二个SNP位点作为判断剑麻H.11648原始母本来源的判断依据。由于被子植物细胞质基因组母系遗传的特征，结合剑麻H.11648的系谱关系，从第一个SNP位点即可判断其原始母本为假菠萝麻。

3 小结与讨论

植物细胞质基因分布在叶绿体、线粒体等细胞器中，与核基因一样，具备完备的复制与表达功能，但其遗传方式却不遵守孟德尔遗传定律。叶绿体在裸子植物中一般为父系遗传，而在被子植物中多为母系遗传[8，9]。本研究利用Pfu高保真酶的扩增进而通过测序获得的psbA-trnH序列信息。按照母系遗传的学术观点，后代与母本的质体遗传信息具有一致性。本研究结果表明，蓝剑麻与另外2份种质存在一个C/T的SNP位点差异，而假菠萝麻和剑麻H.11648在同一位点保持一致，即确定了剑麻H.11648的细胞质来源于假菠萝麻。蓝剑麻、假菠萝麻和剑麻H.11648的psbA-trnH序列差异从叶绿体基因水平上为剑麻H.11648的细胞质来源提供了可靠的参考依据。结合前人的资料记载，本研究确定了剑麻H.11648是通过（假菠萝麻×蓝剑麻）×蓝剑麻的杂交方式选育而成，而并非（蓝剑麻×假菠萝麻）×蓝剑麻。本研究为剑麻细胞质育种的母本选择提供了参考依据，也为psbA-trnH序列应用于龙舌兰属植物的系统分类奠定了基础。

参考文献：

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