潘力健 刘 磊 尚文静 龚 辉 (复旦大学附属金山医院心血管内科，上海 201508)

血管内皮作为机体最大的内分泌腺，可通过多种机制在凝血和动脉粥样硬化斑块形成过程中起重要作用。已有研究表明，内皮功能失调是动脉粥样硬化形成和发展的始动因素之一，存在于冠心病的发生、发展中，甚至存在于冠心病发病之前〔1〕，因此，深入了解内皮功能紊乱与冠心病之间的关系具有重要价值。瑞舒伐他汀可通过影响一氧化氮(NO)合酶(NOS)的活性，影响血管舒张因子内皮源性NO释放，来调节血管内皮功能〔2〕。而非对称二甲基精氨酸(ADMA)及其特异性水解酶二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(DDAH)是体内维持NOS/NO水平平衡的重要因素，本文拟分析瑞舒伐他汀是否通过DDAH/ADMA通路影响NOS/NO水平，从而来改善血管内皮功能，进而起到治疗冠心病的作用。

1 对象与方法

1.1 一般资料 2013年6月至2014年6月我院在门诊体检的健康志愿者15例，冠心病患者30例。纳入标准:①患者均符合2006年AHA/ACC冠心病和其他动脉粥样硬化性血管疾病二级预防指南中的诊断标准，其中冠脉造影冠状动脉狭窄大于50%;②无严重的心肝肾等脏器疾病;③患者无糖尿病，并且体质指数(BMI)＜30 kg/m2，低密度脂蛋白(LDL)＜2.6 mmol/L。排除标准:①有活动性肝病或肝功能异常、充血性心力衰竭、肾功能不全或出血倾向及过敏体质者;②既往患有结核病，既往服用他汀类药物治疗，存在多种疾病并长期服用多种多类(＞2种;＞2类)药物者。本研究符合本单位伦理学标准并得到批准，且已得到患者与家属的知情同意。

1.2 分组方法 冠心病患者随机分为常规治疗组和瑞舒伐他汀组，每组15例，常规治疗组采取不包含瑞舒伐他汀的常规治疗，瑞舒伐他汀组在常规治疗组的基础上运用小剂量瑞舒伐他汀5 mg口服。4 w后抽取3组静脉血进行后续试验。

1.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) 取各组上清，采用ELISA检查各组血清ADMA、NOS和NO的表达水平，操作步骤严格按照说明书进行。

1.4 外周血循环血管内皮祖细胞(EPCs)分离及培养 取各组新鲜抗凝血液，用磷酸盐缓冲液(PBS)等倍稀释，将稀释血液缓慢加于2倍的淋巴细胞分层液上，水平离心，取细胞层重悬于PBS，洗涤离心后收集细胞于含有血管内皮细胞生长因子、碱性纤维母细胞生长因子、类胰岛素样生长因子、表皮细胞生长因子和5%胎牛血清的EBM-2培养液中，置37℃5%CO2孵箱赔养。72 h后弃掉悬浮细胞，贴壁细胞继续给予完全培养基培养，隔天换液，第7天时收集细胞备用〔3〕。

1.5 流式细胞术检测EPCs免疫表型 收集第7天细胞，流式洗液洗涤，计数，调整细胞浓度为1×106/ml置于流式管中。加入荧光标记的CD146抗体，混匀后4℃标记30 min，洗去未结合的抗体后加入300 μl预冷的洗液重悬于流式管中，流式细胞仪检测，相关软件分析。

1.6 DDAH活性检测 收集第7天细胞，细胞裂解液裂解后取上清，应用分光光度法检测 L-胍氨酸(L-cit)浓度来反映DDAH活性。设定健康对照组的DDAH活性为100%，其他组DDAH活性以与健康对照组的比值来表示。

1.7 DDAH mRNA测定 委托Takala公司进行DDAH引物的设计，收集第7天细胞，采用Trizol一步法提取总RNA，cDNA的制备，将提出的总RNA进行mRNA纯化，在运用纯化的mR-NA进行反转录，用反转录的cDNA进行荧光定量PCR，建立标准曲线，对DDAH mRNA表达进行定量分析。

1.8 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结果

2.1 各组血清ADMA、NOS和NO浓度变化 血清NO含量，常规治疗组及瑞舒伐他汀组含量均明显低于健康对照组，瑞舒伐他汀组含量明显高于常规治疗组(P＜0.05);血清NOS含量，常规治疗组及瑞舒伐他汀组含量均明显低于健康对照组，瑞舒伐他汀组含量明显高于常规治疗组(P＜0.05);血清ADMA含量，常规治疗组及瑞舒伐他汀组含量均明显高于健康对照组，瑞舒伐他汀组含量明显低于常规治疗组(P＜0.05)。见表1。

表1 各组血清ADMA、NOS和NO含量(±s，n=15)

表1 各组血清ADMA、NOS和NO含量(±s，n=15)

与健康对照组相比:1)P＜0.05;与常规治疗组相比:2)P＜0.05

组别 NO(μmol/L) NOS(μmol/L) ADMA(ng/ml)95.23±5.62 34.95±5.23 180.65±6.99常规治疗组 69.21±6.011) 10.97±4.961) 260.78±6.261)瑞舒伐他汀组 76.91±5.491)2) 16.55±5.341)2)231.53±4.521)2)健康对照组

2.2 各组EPCs中CD146表达比例变化 常规治疗组〔(60.59±4.63)%〕及瑞舒伐他汀组EPCs中CD146表达比例〔(68.22±5.11)%〕均明显低于健康对照组〔(75.65±5.96)%〕，瑞舒伐他汀组比例明显高于常规治疗组(P＜0.05)。

2.3 各组EPCs中DDAH活性变化 健康对照组的DDAH活性为100%，常规治疗组(49.24%±5.65%)及瑞舒伐他汀组DDAH活性(62.13%±3.48%)均明显低于健康对照组，瑞舒伐他汀组活性明显高于常规治疗组(P＜0.05)。

2.4 各组EPCs中DDAH mRNA表达变化 常规治疗组(0.60±2.34)及瑞舒伐他汀组 DDAH mRNA相对表达量(0.71±3.82)均明显低于健康对照组(1.00)，瑞舒伐他汀组活性明显高于常规治疗组(P＜0.05)。

3 讨论

血管内皮是体内重要屏障，通过多种机制参与动脉粥样硬化斑块形成过程。研究证实，内皮功能紊乱与冠心病的发生发展密切相关，其机制可能与以下相关:①内皮功能紊乱可导致生成的NO含量减少，对LDL氧化修饰的抑制度降低，LDL生成增加，从而促进了血管内膜脂质的沉积〔4〕;②NO可与体内相关物质结合提高组织型纤溶酶原激活剂的活性，并且可抑制血小板聚集，影响血管内炎性因子的分泌和调节，破坏血管内皮影响血管功能〔5〕;③NO含量减少，导致内皮素-1分泌增加，促进了细胞的增殖和血管调节，导致了血管的损伤，从而促进了冠心病的产生;④内皮功能紊乱可导致氧自由基生成增多，使血管扩张受抑制，使其抗血栓、抗黏附等能力降低，有利于冠心病的发生;⑤内皮细胞受损，黏附因子表达增加，促进了细胞间的黏附结合，使形成脂质斑块的能力增强〔6〕。NO在体内是以L-精氨酸为底物，经NOS催化而生成，体内的ADMA为内源性NOS抑制物，可抑制NO的合成，导致内皮功能紊乱。DDAH是ADMA的特异性水解酶，位于内皮样细胞中，它在调节组织和细胞内ADMA水平中起关键作用，多数研究人员认为，DDAH/ADMA通路与NO的生成、分泌、降解等密切相关〔7〕。

瑞舒伐他汀在临床上的推广多得益于调节血脂水平(尤其是LDL)来稳定和逆转动脉粥样硬化斑块，从而改善糖尿病患者的临床症状。不过近来发现，其具有独立于调脂治疗以外的多效性作用，如:抗炎作用，改善内皮细胞的作用，抑制平滑肌细胞增殖，抑制血栓形成的作用，抑制肿瘤细胞的增殖、诱导分化或凋亡等作用，其中改善血管内皮功能的作用倍受关注〔8〕。瑞舒伐他汀对血管内皮功能影响的可能机制有:①增加NO的释放和利用度，降低LDL生成，从而减少了脂质的沉积;②增加LDL氧化阻力;③抑制炎性反应;④促进斑块稳定等〔9，10〕，但其具体机制仍未明确。

本研究提示了瑞舒伐他汀可能通过影响NO/NOS通路来发挥药理作用。CD146是目前公认的EPCs特异标记分子，瑞舒伐他汀可通过调整EPCs来起到治疗作用。瑞舒伐他汀可能通过影响DDAH/ADMA通路来影响内皮功能，从而达到治疗作用。然而，瑞舒伐他汀通过何种机制影响DDAH/ADMA通路，并且阻断DDAH/ADMA通路是否可以阻断瑞舒伐他汀的治疗作用，还需要深入研究。

1 桑甜甜，刘 芳.内皮祖细胞与沉默信息调节因子2相关酶1在心血管疾病中作用的研究进展〔J〕.中国心血管杂志，2013;18(4):317-9.

2 陈 懿，徐世鄂.瑞舒伐他汀和阿托伐他汀对冠心病患者的调脂作用和安全性比较〔J〕.中国老年学杂志，2014;34(9):2389-90.

3 苗巧巧，陈 慧.血管内皮祖细胞与脑血管性疾病〔J〕.医学综述，2012;18(16):2542-4.

4 王 锋.2型糖尿病合并冠心病患者血清C反应蛋白和血清血管细胞黏附分子-1表达及瑞舒伐他汀钙的干预作用〔J〕.中国老年学杂志，2013;33(4):913-4.

5 李 阳，曾高峰.非对称性二甲基精氨酸、内皮祖细胞与冠心病关系的研究进展〔J〕.中国循证心血管医学杂志，2013;13(6):674-5.

6 曹一显，李良平.非酒精性脂肪性肝炎与内皮功能异常和动脉粥样硬化的关系〔J〕.中华肝脏病杂志，2014;22(3):205-8.

7 王中群，杨永宗，严金川，等.免疫应答与动脉粥样硬化〔J〕.中华老年心脑血管病杂志，2013;15(11):1216-7.

8 韩健雄，王小扁，胡泽平，等.瑞舒伐他汀对实验性动脉粥样硬化兔动脉平滑肌细胞骨桥蛋白表达的影响〔J〕.安徽医科大学学报，2012;47(2):126-9.

9 冯雪茹，张婧薇，刘梅林，等.瑞舒伐他汀对中国颈动脉粥样硬化患者内中膜厚度和安全性的荟萃分析〔J〕.中华心血管病杂志，2014;42(3):247-53.

10 杜瑞雪，叶 平，颜光涛，等.瑞舒伐他汀强化治疗对外周动脉粥样硬化患者粘附分子的影响及上游机制〔J〕.南方医科大学学报，2012;32(11):1610-4.