许柏艳,李 佥,*,田 晶,*,徐龙权

(1.大连工业大学 生物工程学院,辽宁大连 116034;2.大连工业大学 现代教育技术部,辽宁大连 116034)

文冠果果壳皂甙的分离纯化及其抗氧化活性研究

许柏艳1,李 佥1,*,田 晶1,*,徐龙权2

(1.大连工业大学 生物工程学院,辽宁大连 116034;2.大连工业大学 现代教育技术部,辽宁大连 116034)

采用AB-8大孔树脂对文冠果果壳皂甙进行纯化,研究了上样液质量浓度、乙醇体积分数、洗脱液流速和氢氧化钠质量分数对纯化效果的影响,进一步通过正交实验获得最佳工艺条件。实验结果表明,当上样液质量浓度为30 g/L,乙醇体积分数为70%,洗脱液流速为2.0 BV/h,氢氧化钠质量分数为0.20%时,纯化后的文冠果果壳皂甙纯度为67.81%,回收率为64.04%,并具有较强的抗氧化活性,能够有效清除DPPH自由基。

文冠果果壳皂甙,AB-8大孔树脂,纯度,回收率,抗氧化活性

文冠果,别名木瓜、文官果、僧灯毛道,是我国特有的珍稀木本油料作物,为无患子科文冠果属,分布于辽宁、河北、陕西等省,其干燥茎、枝能祛风除湿,消肿止痛,主要用于治疗风湿性关节炎等疾病,已列入《中华人民共和国药典》[1]。文冠果果壳是文冠果进行油品加工后的主要废弃物,含有大量五环三萜类皂甙成分。与大多数皂甙的理化性质类似,文冠果果壳皂甙也是糖的衍生物,具有结构复杂,分子量较大,不易结晶,易吸潮,有苦味或辛辣味等特点;同时极性较大,易溶于热水、热乙醇、甲醇、正丁醇,难溶于丙酮、乙醚、乙酸乙酯等有机溶剂,并且具有发泡性、溶血性和显色性。文献报道,文冠果果壳皂甙在抗炎、抗肿瘤、抑制HIV蛋白酶、改善学习记忆等方面具有独特的药理特性[2-4],因此文冠果果壳资源的深度开发与高值化利用对食品、药品及保健品行业的发展具有非常重要的意义。

目前,皂甙的分离纯化方法主要有萃取法、硅胶柱层析法以及大孔吸附树脂法。萃取法需要使用大量的有机溶剂并且分离纯度不高[5],而硅胶柱层析法对原料的预处理要求较为苛刻,分离成本也较高[6]。与之相比,大孔吸附树脂法作为一种简便高效的方法,近来已被广泛地应用于分离纯化人参皂甙[7]、大豆皂甙[8]、黄芪皂甙[9]、苦瓜皂甙[10]、豆角皂甙[11]等,纯化率达54.61%～69.04%,并且具有稳定性高、选择性强、解吸条件温和、成本低廉、无污染、可再生等优点[12]。大孔吸附树脂应用于皂甙类成分的富集纯化具有很好的效果,但其吸附性能及其解吸、纯化条件参数因所分离物质的理化性质不同而不同[13]。本文以文冠果果壳为实验原料,采用AB-8大孔吸附树脂对文冠果果壳皂甙的分离纯化工艺进行深入研究,进一步分析了文冠果果壳皂甙对DPPH自由基的清除能力。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

文冠果果壳 内蒙古赤峰林场;AB-8大孔树脂 南开大学化工厂;齐墩果酸 大连美仑生物技术有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 西安沃尔森生物技术有限公司;抗坏血酸(VC)、香草醛、浓硫酸、正丁醇 天津市科密欧化学试剂有限公司;乙酸乙酯、氢氧化钠 天津市东丽区天大化学试剂厂;盐酸 辽宁新兴试剂有限公司;甲醇 北京化工厂;无水乙醇 大连市酒精厂。

T500型电子天平 美国双杰兄弟(集团)有限公司;RE-52旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;Lambda-35型紫外分光光度计 美国PE公司;HH-8数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;SHZ-D真空抽滤泵 巩义市英峪华仪器厂;TGL-16G高速离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制 以齐墩果酸为标准物,采用香草醛-硫酸法于537 nm处进行测定[14]。

1.2.2 文冠果果壳粗皂甙的提取 用微型植物粉碎机将文冠果果壳粉碎并过20目筛。用电子天平称取干燥至恒重的文冠果果壳粉末200.0 g,置于5000 mL三角瓶中,加入70%的乙醇溶液1400 mL,在70 ℃下加热回流提取4 h;然后用布氏漏斗进行抽滤,将滤液减压蒸馏回收乙醇至20%,室温静置过夜;过滤除去胶质,继续回收乙醇得浸膏26.0 g。将浸膏8倍水量溶解,3500 r/min离心分离15 min,取上清液。加入等体积的乙酸乙酯萃取2～3次,静置,待明显分层后,取下层液,称为萃取液A;向萃取液A中加入等体积的水饱和正丁醇萃取2～3次,静置,待分层后,取上层液,称为萃取液B;将萃取液B倒入500 mL烧瓶中,置于旋转蒸发仪上,70 ℃下旋转蒸发,进一步烘干后得到粗皂甙粉末[15-16]。用电子天平准确称量,得到的粗皂甙粉末为5.275 g。依此计算:文冠果果壳皂甙得率(%)=粗皂甙粉末质量(g)/文冠果果壳粉末质量(g)×100。

1.2.3 文冠果果壳皂甙分离纯化工艺研究

1.2.3.1 单因素实验 分别配制浓度为10、20、30、40、50 g/L的文冠果果壳粗皂甙溶液,在树脂分离柱中吸附平衡2 h后,用0.2% NaOH溶液洗柱,除去样品中可能存在的单宁、黄酮等杂质;再用去离子水洗柱至流出液呈中性;最后用80%的乙醇以2 BV/h的流速洗柱,将皂甙完全洗脱,收集洗脱液,确定最佳上样液浓度。其它操作条件不变,分别考察体积分数为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液对文冠果果壳皂甙分离纯化过程的影响。进一步研究洗脱液流速为1、1.5、2、2.5、3 BV/h时对皂甙纯化过程的影响。在此基础上,采用质量浓度为0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%的NaOH溶液洗柱,考察不同浓度的NaOH溶液对皂甙纯化过程的影响。

1.2.3.2 正交实验 在单因素实验基础上,进一步采用L9(34)正交表(表1),确定各因素的实验水平,对文冠果果壳皂甙纯化过程进行研究。每个实验平行测定3次,从而确定文冠果果壳皂甙的最佳分离纯化工艺条件。

表1 正交实验因素与水平表

1.2.4 文冠果果壳皂甙含量、纯度及回收率的计算 准确称取文冠果果壳粗皂甙20 mg,置于10 mL容量瓶中,加入适量甲醇使其完全溶解,定容至刻度并摇匀,根据1.2.1中的标准曲线计算皂甙含量及纯度。

在AB-8大孔树脂分离纯化文冠果果壳皂甙的实验中,准确移取100 μL洗脱液,按照1.2.1方法测定皂甙的质量浓度C1(g/L),并乘以洗脱液体积V1(L)得到纯化后的总皂甙质量(g),再根据洗脱液干燥至恒重后的质量m1(g)、上样液中文冠果果壳皂甙的质量浓度C0(g/L)和上样液体积V0(L),即可计算出经大孔树脂分离纯化后文冠果果壳皂甙的纯度P和回收率R:

P(%)=(C1×V1)/m1×100

式(1)

R=(C1×V1)/(C0×V0)

式(2)

1.2.5 文冠果果壳皂甙的DPPH清除活性分析 准确称取DPPH 25.8 mg,用无水甲醇定容至100 mL,得到质量浓度为0.258 g/L的DPPH母液,再稀释成质量浓度为0.0515 g/L的DPPH标准溶液,避光备用。取不同质量浓度的纯化后文冠果果壳皂甙溶液,并以VC为阳性对照,根据文献方法计算出其对DPPH自由基的清除率[17-18]。为了便于比较二者抗氧化活性的强弱,选用IC50值(清除率为50%时的质量浓度值)作为其清除DPPH自由基能力的测定指标,IC50值越小,说明对DPPH自由基的清除能力越强。

1.3 数据统计分析

所有实验至少重复3次,采用SPSS 17.0进行实验设计和数据分析,并用Origin 7.5科学绘图软件进行制图。

2 结果与讨论

2.1 文冠果果壳皂甙测定的标准曲线

标准曲线为y=0.0055x-0.0090,R2=0.9985,x为齐墩果酸标准品质量浓度(μg/mL),y为吸光值。

2.2 文冠果果壳皂甙的含量及纯度

采用乙醇回流法提取文冠果果壳皂甙,得率为2.64%,纯度为30.31%,文冠果果壳皂甙含量为0.80%,与文献报道的文冠果果壳总皂甙含量基本一致[15-16,19-20]。

2.3 单因素实验

2.3.1 上样液质量浓度对文冠果果壳皂甙纯化效果的影响 如图1所示,随着上样液质量浓度的增加,文冠果果壳皂甙的纯度和回收率均呈现先增后减的规律,且都在30 g/L时达最大值。这主要是由于,上样液质量浓度较低时,皂甙分子容易被树脂吸附,使纯度和回收率增大;而上样液质量浓度过高时,树脂表面过量吸附的一些分子,会阻碍部分皂甙分子进入树脂内部,从而导致吸附率下降,使纯度和回收率有所降低[21]。据此选择上样液质量浓度30 g/L为较适宜的操作条件。

图1 上样液质量浓度对皂甙纯化的影响Fig.1 Effect of sample solution concentrationon saponin purification

2.3.2 乙醇体积分数对文冠果果壳皂甙纯化效果的影响 由图2可知,随着乙醇体积分数的增加,大孔树脂吸附的皂甙更容易被洗脱下来,因此皂甙的纯度和回收率逐渐升高。当乙醇体积分数达到80%时,皂甙的回收率和纯度都达最大值,分别为54.90%和58.13%。进一步增加乙醇体积分数,由于一些吸附在树脂上的非极性成分也被洗脱下来,会使皂甙纯度和回收率均有所降低[22]。因此,选择80%为较适宜的乙醇体积分数。

图2 乙醇体积分数对皂甙纯化的影响Fig.2 Effect of ethanol volume fractionon saponin purification

2.3.3 洗脱液流速对文冠果果壳皂甙纯化效果的影响 如图3可以看出,洗脱液流速在一定程度上会影响皂甙的洗脱程度。较慢的流速可以使皂甙分子充分地溶于洗脱液中,使总体洗脱量增加,进一步提高回收率和纯度。当流速继续增大时,部分皂甙分子可能来不及被洗脱液洗脱,仍吸附在树脂柱上,导致回收率和纯度降低。综合考虑纯度和回收率两个因素,确定较适宜的洗脱液流速为2.0 BV/h。

图3 洗脱液流速对皂甙纯化的影响Fig.3 Effect of eluent flow rate on saponin purification

2.3.4 NaOH质量分数对文冠果果壳皂甙纯化效果的影响 如图4可知,NaOH质量分数较低时,粗皂甙中可能含有的单宁和黄酮等杂质解离不完全,仍吸附在树脂上,导致皂甙分子在树脂表面的吸附量下降,回收率较低;进一步用乙醇洗脱时,这些杂质也被一同洗脱下来,因此纯化效果较差;当NaOH质量分数较高时,由于单宁和黄酮类物质完全解离,呈离子化状态而被洗脱除去,同时部分皂甙分子也被洗脱下来,所以回收率和纯度都降低[22]。综合考虑回收率和纯度,确定较适宜的NaOH质量分数为0.20%。

图4 NaOH质量分数对皂甙纯化的影响Fig.4 Effect of NaOH mass fraction on saponin purification

2.4 正交实验结果与分析

在单因素实验基础上,采用L9(34)正交设计方法,实验结果如表2所示。

对于文冠果果壳皂甙的分离纯化过程,希望能兼顾产品纯度和回收率。由表2中的正交实验结果,综合考虑纯度以及回收率,使其权重各占50%,通过综合得分(Total Points,TP)确定较优的分离纯化条件为A2B1C2D3,此时文冠果果壳皂甙的纯度为66.26%,回收率为62.58%。

根据表2的极差分析可知,文冠果果壳皂甙纯化效果影响因素的主次关系分别为,A>B>D>C,并且A2B1C2D2为较好条件,通过实验得出该操作条件下文冠果果壳皂甙的纯度为67.81%,回收率为64.04%,均高于正交实验A2B1C2D3的结果。进一步由表3的方差分析结果可知,因素A、B、D均对文冠果果壳皂甙的纯化过程有显著性影响,而因素C对该过程无显著性影响。

表2 正交实验结果

注:
注:TP=(Pi/Pmax×50%+Ri/Rmax×50%)×100,i=1,2,3……9。

表3 正交实验方差分析表

注:
注:α为F0.05(2,2)=19.0。

综上所述,采用AB-8大孔树脂分离纯化文冠果果壳皂甙的最佳工艺条件为A2B1C2D2,即上样液质量浓度为30 g/L,乙醇体积分数为70%,洗脱液流速为2.0 BV/h,NaOH质量分数为0.20%,此时文冠果果壳皂甙的纯度为67.81%,回收率为64.04%。

2.5 文冠果果壳皂甙的DPPH清除活性分析

实验结果如图5所示，由图5可以看出,随着文冠果果壳皂甙质量浓度的增加,其对DPPH自由基的清除率逐渐增大,说明皂甙质量浓度与抗氧化活性存在一定的量效关系。当质量浓度较低时,文冠果果壳皂甙的抗氧化活性较弱,其对DPPH自由基的清除率为相同浓度VC清除能力的29%～67%。当文冠果果壳皂甙质量浓度增加至2.0 g/L时,对DPPH自由基的清除率可达90.17%。进一步得出VC和文冠果果壳皂甙的IC50值分别为0.154 g/L和0.41 g/L,说明纯化后的文冠果果壳皂甙具有较强的清除DPPH自由基的能力。

图5 纯化后文冠果果壳皂甙与VC对DPPH自由基的清除率Fig.5 Comparison of DPPH free radical scavenging activitybetween purified X. sorbifolia husk saponin and VC

3 结论

本实验采用乙醇回流法提取文冠果果壳皂甙,得率为2.64%,皂甙含量为0.80%。利用AB-8大孔树脂对文冠果果壳皂甙进行分离纯化,获得最佳纯化工艺条件为:上样液质量浓度30 g/L,乙醇体积分数70%,洗脱液流速2.0 BV/h,NaOH质量分数0.20%。纯化后文冠果果壳皂甙的纯度为67.81%,是纯化前皂甙纯度的2.24倍,同时皂甙的回收率可达64.04%。实验结果表明,VC和文冠果果壳皂甙的IC50值分别为0.154 g/L和0.41 g/L,说明纯化后的文冠果果壳皂甙具有较强的清除DPPH自由基的能力。这将为文冠果果壳的资源化利用及其在食品、保健品行业的深入开发提供基础数据。

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Study on purification of the saponin fromXanthocerassorbifoliahusk and analysis of the antioxidant activity

XU Bai-yan1,LI Qian1,*,TIAN Jing1,*,XU Long-quan2

(1.School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China;2.Modern Education Technical Department,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China)

AB-8 macroporous resin was used for the separation and purification of theX.sorbifoliahusk saponin,and the effects of sample solution concentration,ethanol volume fraction,eluent flow rate and NaOH mass fraction were examined for the orthogonal design. Furthermore,the operating parameters were optimized to an overall consideration of purity and recovery,when the sample solution concentration was 30 g/L,ethanol volume fraction was 70%,eluent flow rate was 2.0 BV/h and NaOH mass fraction was 0.20%,the purity of theX.sorbifoliahusk saponin was 67.81%,and the recovery ratio was 64.04%. Besides,the antioxidant activity of theX.sorbifoliahusk saponin was analyzed,and it was indicated that the purifiedX.sorbifoliahusk saponin could effectively scavenge DPPH free radical.

saponin of theX.sorbifoliahusk;AB-8 macroporous resin;purity;recovery ratio;antioxidant activity

2014-10-08

许柏艳(1989-)，女，硕士研究生，主要从事天然活性产物分离及生物转化方面的研究，E-mail:xu005693@126.com。

*通讯作者:李佥(1982-)，女，博士，讲师，研究方向：生物催化与生物分析，E-mail：liqian19820903@163.com。 田晶(1966-)，女，博士，教授，研究方向：生物催化与生物分析，E-mail：tianjing@dlpu.edu.cn。

辽宁省自然科学基金(2013020167)。

TS209

B

1002-0306(2015)15-0252-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.044