徐玉玲，谭 平，罗小伟，潘迎志，吴南轩，梁 悦，刘 涛

(1.成都大学 生物工程学院，四川 成都 610106;2.湖北省 秭归县人民医院，湖北 秭归 443600)

0 引 言

亚麻油渣为胡麻油籽经过压榨或提取其所含植物油后所得的油渣.研究发现，亚麻油渣中含有以亚麻木酚素为代表的具有生理活性的物质，它对雌激素依赖性疾病与骨质疏松等症有预防作用，目前，亚麻木酚素已被开发制成药品和保健品，同时也作为食品的添加剂［1－3］.亚麻木酚素为无色晶形，可溶于水、甲醇、含水乙醇和丙醇，易被酶水解，其提取方法有溶剂浸提法、回流提取法、微生物发酵法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法等［4－5］.本研究主要对亚麻油渣的处理方式、亚麻木酚素的提取工艺及其分离纯化方法进行了研究.

1 材料与仪器

1.1 材 料

实验所用材料包括:亚麻油渣(批号，20130617)，购于山西神池县福渊土特产品开发有限公司;亚麻木酚素对照品(批号，20130617)，由中国食品药品检定研究所提供;AB-8 型大孔吸附树脂，购于天津波鸿树脂科技有限公司;乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯.

1.2 仪 器

实验所用仪器包括:KQ-100 型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)，RE-5205B 型旋转蒸发仪(上海荣生仪器厂)，P2302II 型高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司生产).

2 方法与结果

2.1 色谱条件

实验的色谱条件为:色谱柱，GS-120-5-C18-AP(4.6 nmID ×250 mm，5 mL);流动相为，乙腈和水(70∶ 30)，流速，1 mL/min，检测波长，280 nm，进样量10 μL，柱温25 ℃.

2.2 对照品溶液的制备

取亚麻木酚素标准品10.00 mg，精密称定，置于10 mL 容量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀，制得对照品溶液，其HPLC 图谱见图1.

2.3 供试品溶液的制备

取亚麻油渣颗粒400 g，放于5 000 mL 蒸馏烧瓶中，加3 200 mL 浓度为70%的乙醇溶液，加热回流提取2 h.浓缩提取液至适量，向浓缩液中加入2 mol/L的NaOH 溶液至pH 值为8，一段时间后，加入2 mol/L 硫酸溶液至pH 值为4，离心除沉淀，加入蒸馏水定容至800 mL，制得供试品溶液，其HPLC 图谱见图2.

2.4 线性关系实验

精密吸取对照品溶液，2、4、6、8、10、12、14 μL分别进样，在“2.1”项色谱条件下，测定峰面积，以峰面积Y 对进样量X 进行线性回归得亚麻木酚素线性回归方程，y =368.53X－50.752，r =0.9997.结果表明，亚麻木酚素在1.86 ～13.02 μg 范围内与峰面积呈现良好线性关系.

2.5 测定法

精密量取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，计算.

图1 亚麻木酚素对照品HPLC 图谱

图2 亚麻油渣样品HPLC 图谱

2.6 提取工艺研究

研究发现，亚麻油渣提取过程中的影响因素主要为乙醇浓度、加醇量、提取时间及提取次数4 个因素［6－8］，本实验对此进行了研究.

2.6.1 单因素实验的考察.

相关文献中，选择70%的乙醇溶液作为提取溶媒较多［6－8］，所以本实验选择乙醇浓度为60%、70%、80%，并在这3 个水平进行考察.实验最终确定乙醇浓度为70%.

2.6.2 正交实验因素水平确定.

以乙醇为提取溶媒，选取提取时间(A)、提取次数(B)、加醇倍数(C))为考察因素，以提取液中亚麻木酚素及固含物的量为考察指标，综合加权评分，采用L9(34)正交表安排实验，因素水平表见表1.

表1 提取工艺因素水平表

2.6.3 实验方法与结果.

分别取9 组亚麻油渣药材(每组100 g)，按照正交实验安排表(表2)进行回流提取正交实验，提取液含量测定方法按“2.5”项方法进行.结果如表2所示，方差分析如表3 所示.

表2 正交实验安排及结果

表3 正交试验方差分析表

正交实验结果表明，3 个因素对从亚麻油渣中木酚素提取效果影响顺序从大到小分别为，提取次数＞加醇倍数＞提取时间.方差分析表显示，提取次数和加醇倍数对提取效果影响均显著.综合实验结果，选取A1B3C3作为本提取工艺的最佳参数，即:药材中加入16 倍量70%乙醇，提取3 次，每次1 h.

2.6.4 提取工艺验证实验.

取3 组亚麻油渣颗粒物，1、2 组100 g，3 组200 g，1、2 组加入1 600 mL 70%的乙醇，3 组入3 200 mL 70%的乙醇分别提取3 次，每次1 h，合并提取液，测定提取液中木酚素的含量，结果如表4 所示.

表4 提取工艺验证结果表

验证实验结果表明，本提取工艺稳定、可行.

3 亚麻木酚素的分离纯化研究

3.1 树脂优选实验

为对树脂进行优选，本实验取处理好的HPD100、D101、AB-8、HPD300、HPD600 型大孔树脂各7 g 于100 mL 烧杯中，用移液管移取经离心处理的样品液各50 mL 于各型号大孔树脂中进行吸附，隔10 min、30 min、1 h、2 h 各震荡一次，静置24 h.取适量上清液，测定各树脂吸附亚麻木酚素的含量，测定结果如表5 所示，计算公式为，

表5 不同类型树脂对亚麻木酚素的吸附率

表5 结果表明，AB-8 型大孔树脂对亚麻木酚素的吸附能力最好.

3.2 上样量

取预处理好的20 g AB-8 型大孔树脂装入内径1.6 cm，长30 cm 的玻璃层析柱中，用纯净水洗至无醇味.加入离心处理的样品溶液80 mL 以2 BV/h 流速上样，控制流出液流速3 BV/h ，每5 mL 收集一次流出液，总共收集10 份，结果如图3 所示.

图3 AB-8 型树脂吸附亚麻木酚素的保留率

从图3 可看出，当亚麻木酚素提取液的上样体积加至45 mL 时(9 份)，AB-8 型大孔树脂吸附亚麻木酚素的保留率开始低于95%，可认为AB-8 型大孔树脂柱开始出现泄漏，故初步确定树脂的上样量为45 mL.计算出单位AB-8 型大孔树脂吸附量为3.40 mg/g.

3.3 洗脱溶剂选择

称取5 组预处理好的20 g AB-8 型大孔树脂，分别装入内径2.8 cm，长30 cm 的5 支同规格的玻璃层析柱中，用纯净水洗至无醇味，加入离心处理的样品液45 mL 上样吸附.充分吸附后，用纯净水洗至流出液无色，再分别用10%、20%、30%、40%、50%、的乙醇溶液100 mL 洗脱，并收集各流出液，解吸率结果如表6 所示，其计算公式为，

表6 不同浓度溶剂洗脱下AB-8 型树脂对亚麻木酚素的解吸率

表6 结果表明，30%的乙醇溶液洗脱能力最强.

3.4 洗脱溶剂用量

称取预处理好的20 g AB-8 型大孔树脂，装入内径1.6 cm，长30 cm 的玻璃层析柱中，用纯净水洗至无醇味，加入离心处理的样品液45 mL 上样吸附.充分吸附后，用纯净水洗至流出液无色，再用体积分数为30%的乙醇溶液洗脱，每45 mL 收集一次洗脱液，收集7 次，结果如图4 所示.

图4 不同倍数乙醇对吸附在AB-8 型树脂上亚麻木酚素的解吸率

图4 结果表明，6 BV 的乙醇溶液能对AB-8 型大孔树脂吸附的亚麻木酚素能完全洗脱，其单位AB-8 型大孔树脂吸附量为3.44 mg/g.

3.5 纯化工艺验证

取3 组处理好的AB-8 型大孔树脂，1、2 组20 g，分别装入内径1.6 cm，长30 cm 的2 支同规格玻璃层析柱中(径高比1.6∶ 16)，3 组40 g，装入内径2.6 cm，长20 cm 的玻璃层析柱中(径高比2.6∶ 20)，用纯净水洗至无醇味，1、2 组加入离心处理的样品液45 mL，3 组加入离心处理的样品液90 mL，采用2 BV/h 流速上样，6 BV 的30%乙醇，3 BV/h 洗脱，收集各组洗脱液，测定洗脱液中木酚素的含量，结果如表7 所示.

表7 纯化工艺验证结果表

验证实验结果表明，本纯化工艺稳定、可行.

4 结论与讨论

1)通过正交试验对亚麻木酚素的提取工艺条件进行了优化，得到的最佳工艺为:用体积分数为70%乙醇，料液比1∶ 16，提取3 次，每次1 h.树脂优化实验结果表明:AB-8 型大孔树脂最适合分离纯化亚麻油渣提取物.对上样量的研究、洗脱溶剂选择研究、洗脱溶剂用量研究的优化，得到的最佳纯化工艺为:2 BV/h 流速上样，6 BV 的30%乙醇，3 BV/h洗脱.

2)查阅相关文献发现，大孔树脂的洗脱流速在1 ～5 BV/h 之间变化，对样品的洗脱影响不大［9－11］.考虑到工作效率，本实验选择洗脱流速为3 BV/h 的AB-8 型大孔吸附树脂对样品分离纯化后可重复使用，提高了工艺安全性和经济性.

3)目前国内外报道用亚麻油渣提取制备亚麻木酚素的工艺研究较少，实验所选原药材经过提取后的亚麻油渣仍可作家畜的饲料使用，大大地提高了亚麻油渣的综合利用价值.本研究提取工艺简单，提取溶媒价廉，不采用有机溶媒萃取，不会对环境造成污染，生产成本低，回收后的乙醇仍可以重复使用，极大地降低了生产成本.

4)本实验对溶剂浸提法、回流提取法进行了研究.实验结果表明，回流提取方法更佳，而且回流法提取工艺具有提取周期短，操作便捷，提取效率高，所用溶剂少等优点，故本次实验选取回流法提取工艺.另外，由于亚麻油渣呈颗粒状，研究表明，对其进行粉碎对实验结果有一定影响，但颗粒大小对提取效果影响不大.

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