贺玉萍，张 航，易晓红

(1.成都中医药大学 基础医学院，四川 成都 611137;2.四川大学 华西医院生物治疗国家重点实验室，四川 成都 610041)

0 引 言

重组蛋白在生物化学、信号转导、新药筛选以及疾病治疗等领域具有广泛的需求，其制备工艺包括传统的构建稳定细胞株表达和基因瞬时转染表达.目前，在临床及实验室研究中，往往要求在短时间内生产一定量的候选蛋白供应研究需求，这使得瞬时基因表达技术近年来得到广泛应用［1］.聚乙烯亚胺(polyethylenimie，PEI)是基因瞬时转染广泛使用的转染试剂，具有成本较低、操作简便、适用宿主范围广、转染效率高以及包装容量不受限制等优势［2－4］.真核表达载体pCEP4 包含有EBNA-11 基因、EBNA Orip、CMV 启动子、氨苄抗性和潮霉素筛选标记，可用于稳定和瞬时转染［5］.本研究通过构建真核表达载体pCEP4/EGFP，PEI 介导瞬时转染293-F 细胞，观察转染效率，优化转染条件，拟为后续重组蛋白瞬时表达奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材 料

实验所用材料包括:293-F 细胞和pREP4/EGFP质粒为本实验室保存;pCEP4 质粒购自Life Technologies Corporation;Trans5α 感受态细胞购自北京全式金生物技术公司;限制性内切酶Not I 和Hind III、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、T4 连接酶试剂盒购自TaKaRa;质粒抽提试剂盒购自Omega bio-tek 和Promega;转染试剂支化聚乙烯亚胺(polyethylenimie，branched)购自Sigma-aldrich;FreeStyle 293 Expression Medium 购自gibco;1640 培养液由本实验室配制.

1.2 方 法

1.2.1 重组载体pCEP4/EGFP 构建.

酶切pCEP4、pREP4/EGFP 质粒，并回收目的片段(pCEP4 Not I/Hind III(10.2kb)，EGFP Not I/Hind III(0.8kb)).将回收的目的片段进行连接，连接产物转化Trans5α 感受态细胞.氨苄青霉素筛选培养，挑取阳性单克隆菌落至LB 液体培养基中，37℃，225 r/min摇菌过夜.提取质粒，Not I/Hind III 双酶切，电泳鉴定.

1.2.2 293-F 细胞的培养及重组载体的PEI 转染.

1)24 孔板.将293-F 细胞接种于专用培养液(FreeStyle 293 Expression Medium)，37 ℃、5% CO2培养.铺板前1 天以7 ×105cells/mL 的密度接种培养，转染前3 h 以0.9 ×106cells/mL 的密度铺24 孔板，置于摇床上培养.配制PEI 浓度为1 mg/mL，pH 值调整为7.0，用0.22 μm 滤膜于洁净条件下过滤;DNA浓度为1 μg/mL.配制DNA/PEI 混合物，N/P 范围10～30，混合时用1640 培养液，室温中放置10 min，转染293-F 细胞，置于摇床上培养，分别于24 h、48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况.

2)悬浮培养.转染前24 h，293-F 以8 × 106cells/mL 的密度接种培养20 mL，悬浮培养.转染时细胞计数，细胞活力应达到90%以上，将细胞稀释为1.5 ×106cells/mL，18 mL;DNA 用量为1 μg/mL，N/P 为25，混合时用1640 培养液，混合液为2 mL，室温中放置10 min.转染后细胞继续悬浮培养，130 r/min.48 h 后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，流式细胞仪检测转染效率.

2 结 果

2.1 pCEP4、pREP4/EGFP 酶切后的目的片段

pCEP4、pREP4/EGFP 经Not I 与Hind III 双酶切后获得的目的片段pCEP4(10.2kb)和EGFP(0.8kb)如图1 所示.

图1 pCEP4/EGFP 酶切后的目的片段

2.2 重组载体pCEP4/EGFP 的酶切鉴定

重组载体pCEP4/EGFP 双酶切鉴定如图2 所示，其与预期结果一致.

图2 pCEP4/EGFP 重组载体的双酶切鉴定

2.3 pCEP4/EGFP PEI 转染293-F 细胞

2.3.1 24 孔板.

转染24 h、48 h 后绿色荧光蛋白表达情况如图3 所示.光镜下观察细胞状态可见，悬浮细胞漂浮成团(24 孔板摇动幅度太小)，随着PEI 浓度的增加，贴壁细胞数目亦增加.当N/P 为25，转染48 h 后，转染效率相对最高.

图3 倒置荧光显微镜观察(×50)

2.3.2 悬浮培养.

悬浮培养排除细胞结团对转染的影响，当N/P为25，转染48 h 后，绿色荧光蛋白表达情况如图4所示.利用流式细胞术检测pCEP4/EGFP 的转染效率为77.57%，结果如图5 所示.

图4 正置荧光显微镜观察(×50)

图5 流式细胞术检测绿色荧光蛋白的表达

3 结 论

基因瞬时转染技术作为一种快捷方便获取重组蛋白的方法，可用于筛选大量蛋白候选药物.PEI 介导的基因瞬时转染效率取决于孵育得到的DNA/PEI 复合物的结构、粒径和表面电荷等因素以及细胞与复合物发生相互作用的过程.在转染条件选择上，主要考虑DNA 的用量，PEI 与DNA 的比例(N/P)［6］，DNA 与PEI 混合孵育的介质、孵育时间以及转染时间、细胞密度［7－10］.本研究以EGFP 为报告基因，探讨了真核表达载体pCEP4 转染293-F 细胞的条件，DNA 用量为1 μg/mL，N/P 为25，混合时使用1640 培养液，室温孵育10 min，转染前24 h 细胞以8 ×106～9 ×106cells/mL 的密度传代，转染时细胞密度为1.5 ×106cells/mL，同时保证细胞活力达到90%以上，可获得较为理想的转染效果.

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