李诺

（嘉应学院 生命科学学院，广东梅州514015）

茉莉酸甲酯对水稻种子萌发过程中蛋白酶活性影响的作用机理探讨

李诺

（嘉应学院 生命科学学院，广东梅州514015）

摘要：研究系列浓度的茉莉酸甲酯（methyl jasmonat,MeJA）、不同激素与MeJA组合对水稻种子萌发过程中所含的BAPNA酶(BAPNA：苯甲酰精氨酸对硝基苯胺,Na-benzoyl-DL-arginine-ρ-nitroanilid)活性的影响，了解水稻种子萌发过程中蛋白酶与贮藏蛋白降解的关系，探讨茉莉酸甲酯是否通过赤霉素（Gibberellins，GA）或脱落酸（Abscisic acid，ABA）途径影响水稻萌发过程中的蛋白酶活性.

关键词：茉莉酸甲酯；水稻种子；蛋白酶

蛋白酶在萌发种子的贮藏蛋白降解中起重要作用，且与种子活力密切相关［1］.它的合成及活性调节一直受到人们重视.单子叶的禾本科植物中，蛋白酶活性与胚分泌激素密切相关［2］.由于水稻（Oryza sativa L.）是淀粉质种子，对水稻种子萌发过程中蛋白酶的合成和活性调节方式了解较少.在种子萌发过程中，贮藏蛋白可能被多种蛋白酶水解，以供应种子萌发时对氨基酸的需求.不少研究表明茉莉酸甲酯与脱落酸都能抑制种子萌发，其作用机理也一样，但对水稻种子而言，脱落酸的抑制作用强于茉莉酸甲酯［3］.Tsai等认为脱落酸抑制水稻幼苗生长是可逆的，而茉莉酸甲酯的抑制作用是不可逆的［4］.水稻种子萌发过程中，蛋白酶基因的表达和调控受到多种激素影响，并可能存在不同的调控途径.本文通过三种常用的检测蛋白酶活性的底物：苯甲酰精氨酸对硝基苯胺、酪蛋白、偶蛋清蛋白，探讨茉莉酸甲酯对水稻种子萌发过程中蛋白酶活性影响是否通过赤霉素途径.

1　　材料与方法

1.1材料

本实验所用水稻（Oryza sativa L.）品种为“桂农占”，由广东省农科院水稻研究所提供；茉莉酸甲酯由日本ZEON公司赠送；多效唑（PP333）的15%可湿性粉剂由华南农业大学生命科学学院提供；其它激素均购自上海生化试剂厂.

1.2水稻种子萌发处理

选取颗粒饱满无菌斑的水稻种子用5%次氯酸钠溶液消毒10 min，无菌水清洗6次，放入已灭菌的垫有一层滤纸的培养皿内，并加入适量无菌水，每个培养皿放置100粒水稻种子，培养7天（28±1℃），培养期间定时观察，根据实际情况添加或更换培养液.

1.3形态指标测定

计算水稻种子的萌发率.

1.4粗酶液的提取

分别取20粒正常萌发的与去胚处理的水稻种子，加入10 mL pH7.2,0.02 mol/L磷酸缓冲液（含10 mmol/Lβ－巯基乙醇），研磨成匀浆，4℃、5 000 g、离心10 min，取上清液得到粗酶液.

1.5酶活性的测定（BAPNAase酶活性的测定）

以BAPNA作为反应底物，按照Doi等的方法进行测定［5］.以波长410 nm下的OD值每分钟增加0.001 为1个酶活性单位.

1.6盐溶蛋白含量的测定

盐溶蛋白用10%NaCl提取，按照Bradford［8］的方法测定蛋白质含量，用牛血清白蛋白做标准曲线.

1.7谷蛋白含量的测定

参照宾金华等的方法［6］，用0.2%NaOH提取碱溶蛋白，碱溶蛋白减去盐溶蛋白即为谷蛋白.按照Bradford的方法测定蛋白质含量［13］，用牛血清白蛋白做标准曲线.

1.8 各种处理及其相对应的表示符号

表1　　培养水稻种子的各种溶液以及相应的表示符号

以上实验均重复三批处理，每批处理重复三次，取平均值.

2　　结果与分析

2.1 各种处理对水稻萌发的影响

与水对照相比，除了A(4)和M(7)+A(4)处理之外，其它各种处理的萌发率都达到97%以上（见图1），A(4) 和M(7)+A(4)处理降低了水稻种子的萌发率，M(7)+A(4)处理的萌发率略高于A(4)处理，说明10-4mol/L ABA抑制水稻种子的萌发，10-7mol/L MeJA能缓解10-4mol/L ABA的抑制作用，但10-5mol/L ABA的抑制作用不很明显.表明只有10-4mol/L ABA对水稻种子的萌发率有明显影响.

图1　　各种处理对水稻种子萌发的影响

2.2各种处理对水稻种子萌发过程中以BAPNA为底物的蛋白酶活性的影响

各种处理对BAPNA酶活性没有明显影响，其中M(4)和G(4)处理对BAPNA酶活性有轻微促进作用，而M(7)、P(3)、P(4)、A(4)、A(5)处理有轻微的抑制作用；当M(7)分别与P(3)、P(4)、A(4)、A(5)的组合时，M(7)对BAPNA酶活性却表现出轻微促进作用，如图2所示.

图2　　各种处理对萌发水稻种子盐溶蛋白含量的影响

2.3各种处理对萌发水稻种子盐溶蛋白含量的影响

M(4)、M(7)处理的盐溶蛋白含量略高于水处理，P(3)、P(4)、A(4)、A(5)分别与M(7)的组合处理的盐溶蛋白含量都要比它们本身单独处理时高，如图3所示.这与蛋白酶活性的现象有点相似，MeJA对盐溶蛋白的降解具有一定的抑制作用，而M(4)和G(4)处理的盐溶蛋白含量与M(4)+G(4)处理的含量并无明显差异.

2.4各种处理对萌发水稻种子谷蛋白含量的影响

与水对照相比，仅有M(7)、G(4)处理的谷蛋白含量略低.P(3)、P(4)、A(4)、A(5)分别与M(7)的组合处理的谷蛋白含量都要比它们本身单独处理时低，M(4)处理的谷蛋白含量高于水对照，如图4所示.M(4)、G(4)处理的谷蛋白含量和M(4)与G(4)组合处理的含量无明显差异.这表明G(4)能够轻微促进谷蛋白的降解，但不能逆转M(4)抑制谷蛋白的降解.M(7)对谷蛋白降解有轻微的促进，而P(3)、P(4)、A(4)、A(5)表现出明显的抑制，10-7mol/L MeJA促进水稻种子萌发与谷蛋白的降解相关.

图3　　各种处理对萌发水稻种子盐溶蛋白含量的影响　

图4　各种处理对萌发水稻种子谷蛋白含量的影响

3　　讨论

本实验分别检测了赤霉素、脱落酸、多效唑及其与茉莉酸甲酯的组合对水稻种子萌发过程中蛋白酶活性的变化及贮藏蛋白降解情况.实验结果显示M(7)对BAPNA酶活性的促进作用可能受内源赤霉素抑制，高浓度（10-4mol/L）的茉莉酸甲酯对BAPNA酶有轻微的促进作用，并能部分抑制赤霉素引起的BAPNA酶活性升高.因此，可以认为在水稻种子正常萌发的时候，由内源赤霉素调控的信号转导途径可能在BAPNA酶活性表达中起主要作用.从各种处理的水稻种子的盐溶蛋白含量来看，茉莉酸甲酯对盐溶蛋白的降解具有一定的抑制作用，并比P(3)、P(4)的抑制作用要强，比A(4)、A(5)的抑制作用要弱，M(4)和G(4)单独处理的盐溶蛋白含量与两者组合处理的含量无明显差异.从各种处理的谷蛋白含量来看，M(4)抑制谷蛋白的降解，M (7)表现轻微促进谷蛋白的降解，P(3)、P(4)、A(4)和A(5)对谷蛋白降解表现抑制，G(4)对谷蛋白的降解也有一定的促进作用.结合种子萌发、蛋白酶活性的变化和贮藏蛋白的降解情况来看，可以认为10-7mol/L茉莉酸甲酯可能通过提高内源赤霉素水平，促进蛋白酶活性提高，从而诱导谷蛋白的修饰与降解，为水稻种子萌发提供必需的氮素营养，实现对水稻萌发的促进作用.

参考文献：

［1］宾金华，傅家瑞.不同活力花生种子子叶内肽酶活性及花生球蛋白的降解［J］.热带亚热带植物学报,1995,3(3)：79-83.

［2］Shutov A D，Vaintraub I A.Degradation of storage protein in germinating seeds［J］.Phytochem,1987(26)：1557-1566.

［3］Wilen R W，Ewan B E,Gusta L V.Interaction of abscisicacid and jasmonic acid on the inhibition of seed germinationand the induction of freezing tolerance［J］.Can Bot,1994(72)：1009-1017.

［4］Tsai F Y，Lin C C，Kao C H.A comparative study of theeffects of abscisic acid and methyl jasmonate on seedlinggrowth of rice ［J］.Plant Growth Reg,1997(21)：37-42.

［5］Doi E，Shibata D，Matoba T，et al.Evidence for thepresence of two types acid proteinases in germinating seedsof rice［J］.Agric Biol Chem,1980(44)：435-436.

［6］宾金华，黄胜琴，何树春，等.茉莉酸甲酯对水稻种子萌发和贮藏物质降解的影响［J］.植物学报,2001,43(6)：578-585.

（责任编辑：闫文龙）

中图分类号：O29；F830.9

文献标识码：A

文章编号：1007-5348（2015）08-0041-04

［收稿日期］2015-06-02

［基金项目］2014年广东省高等教育学会实验室管理专业委员会基金项目（GDJ2014076）.

［作者简介］李诺（1979-），女，广东梅州人，嘉应学院生命科学学院讲师，硕士；研究方向：植物学.

Effects of Methyl Jasmonate on the Protease Activities During Rice （Oryza sativa L.）Germination

LI Nuo
（College of Life Sciences,JiaYing University，Meizhou 514015,Guangdong,China）

Abstract：The effects of methyl jasmonate(MeJA),MeJA combining other phytohormones and different inhibitors of proteases on the protease activities of germinated rice seeds or cultured embryoless rice grains were studied. It concluded that MeJA maybe influence the de novo synthesizing of the cysteine protease and then influence the germination of rice seeds.

Key words:methyl jasmonate;rice seeds;protease