刘春卯，贺学礼，陈严严，王晓乾，姜桥

（1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2.河北省微生物研究所 酶工程实验室，河北 保定 071051）

蒙古沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）属豆科沙冬青属，是我国荒漠地区特有的常绿阔叶灌木，国家珍稀濒危保护植物［1］，主要分布于宁夏吴忠、中卫，内蒙古瞪口、乌海、贺兰山、阿左旗、阿右旗和甘肃民勤等地，具有抗寒、抗冻、抗高温、抗干旱等特性，在防风固沙和水土保持中发挥着重要作用［2］.

AM（arbuscular mycorrhizae）真菌是一类能与绝大多数高等植物根系形成共生关系的土壤真菌.AM 真菌可通过根外菌丝在相同或不同种植物根系间建立起物质和信息传递的桥梁，提高植物对土壤水分和矿质营养的吸收利用，促进植物生长［3］.研究表明，AM 真菌遍布不同生态系统［4－7］，在退化生态系统植被恢复和生态建设中发挥着重要作用［8－11］.目前，有关AM 真菌物种多样性季节或月份间变化的研究时有报道［12－14］，但未见对不同年际AM 真菌的研究.

本实验选取宁夏银川、沙坡头和甘肃民勤3个样地，通过连续2年同一月份样品采集和分析，对蒙古沙冬青根围AM 真菌物种多样性特征及其生态分布规律进行研究，初步揭示了蒙古沙冬青与AM 真菌共生关系，并筛选出其根围AM 真菌优势种，这为保护和促进蒙古沙冬青生长提供理论依据，为利用菌根生物技术促进荒漠植被恢复提供理论基础.

1 材料和方法

1.1 样地概述

3个样地经纬度、海拔、降水量等基本情况见表1.

表1 样地基本情况Tab.1 Basic situations of sampling sites

1.2 样品采集

2012年7月和2013年7月，分别在宁夏银川、沙坡头和甘肃民勤3个样地随机选取生长良好的蒙古沙冬青植株，在贴近植株根颈部分5个土层：0～10，10～20，20～30，30～40，40～50cm 挖取土壤剖面，按顺序进行土样采集，装入有编号的塑料袋密封带回实验室.土样在自然风干后过2mm 筛，对AM 真菌和土壤理化性质进行鉴定和测定.

1.3 AM 真菌多样性测定

孢子分离采用湿筛倾析－蔗糖离心法［15－16］.将筛取的AM 真菌孢子在体视显微镜下观察，并通过记录孢子数量、颜色、大小、连孢菌丝特征等，结合Schenck［17］“VA 菌根鉴定手册”和INVAM（http：／／invam.caf.wvu.edu）提供的鉴定资料，对孢子种类进行鉴定，并筛选出优势种.

相关计算公式如下：

物种丰度（Species Richness，SR）＝某种AM 真菌总种次数／土样数.

分离频度（Frequency，F）＝（AM 真菌某属或种的孢子数／土样数）×100%.

相对多度（Relative Abundanc，RA）＝（AM 真菌某属或种的孢子数／AM 真菌总孢子数）×100%.

重要值（Important value，I）＝（F＋AR）／2.本文将AM 真菌重要值划分为4个等级，即I＞60%为优势属（种），40% ＜I≤60%为亚优势属（种），20%＜I≤40%为伴生属（种），I ≤20%为偶见属（种）.

Sorensen相似性系数：Cs＝2j／（a＋b），j为AM 真菌在2个样地共有的物种数量，a代表A 样地总种数，b代表B样地总种数.

多样性采用Shannon－Wiener指数（H）和Simpson指数（D）来表示

式中：Pi为某样地土壤内种i的孢子级数（Ni）与该地区土壤AM 真菌孢子总级数（N）之比，即Pi＝Ni／N，S 为某样地AM 真菌种数.

1.4 土壤指标测定

脲酶用He等［18］方法测定；磷酸酶参照Tabatabai和Bremner法测定［19］；球囊霉素用Wright等［20］方法测定；有机质用灼烧法；速效氮用碱解扩散法；速效磷用碳酸氢钠浸提－钼锑抗比色法；速效钾用四苯硼钠比浊法测定.

1.5 数据处理

实验数据通过SPSS19.0生物统计软件进行方差分析、主成分分析，并利用Excel，Canaco作图.

2 结果与分析

2.1 AM 真菌种质资源

本实验共分离鉴定出AM 真菌5属36种，其中球囊霉属Glomus 16种，约占44.5%；无梗囊霉属Acaulospora13种，约占36.1%；盾巨孢囊霉属Scutellospora3种，约占8.3%；管柄囊霉属Funneliformis 3种，约占8.3%；多孢囊霉属Diversispora1种，约占2.8%.多孢囊霉属仅在沙坡头样地分布，其他各属在不同样地均有分布.

不同年份，AM 真菌在各样地分布略有差异（表2）.2013年与2012年相比，银川样地分离出蜜色无梗囊霉和浅窝无梗囊霉，沙坡头样地分离出孔窝无梗囊霉，民勤样地分离出细凹无梗囊霉和沙荒球囊霉，而异配盾巨孢囊霉在沙坡头样地未出现.

表2 AM 真菌分布及年际间变化Tab.2 Distribution and inter－annual variation of AM fungi

续表2Continue tab.2

2.2 AM 真菌属分离频度、相对多度和重要值

由表3可知，2012年和2013年，球囊霉属是3样地共有优势属；无梗囊霉属、管柄囊霉属和盾巨孢囊霉属是3样地共有亚优势属；多孢囊霉属是沙坡头样地偶见属.

表3 不同样地AM 真菌各属分离频度（F）、相对多度（RA）和重要值（I）Tab.3 Frequency（F），relative abundance（RA）and importance value（I）of AM fungal genera in different sampling sites

2.3 AM 真菌土层分布

由表4可知，2012年和2013年2年间的AM 真菌孢子密度和种丰度均受土层影响.3样地孢子密度和种丰度均为0～20cm 土层显著高于20～50cm 土层.

表4 不同年份不同土层孢子密度和种丰度Tab.4 Spore density and species richness in different soil layers and different years

2.4 AM 真菌物种多样性年际变化

2012年和2013年AM 真菌多样性相关指标见表5.由表5可见，3样地孢子密度在2013年均有所升高，宁夏银川和甘肃民勤孢子密度变化明显，2013年孢子密度高于2012年.3样地种丰度和多样性指数在年际间无明显变化.甘肃民勤样地孢子密度显著高于宁夏银川和宁夏沙坡头.

表5 不同年份3样地AM 真菌孢子密度、种丰度、香浓－维纳指数和辛普森指数Tab.5 Spore density，species richness，Shannon－Wiener index and Simpson index of AM fungi from three plots in different years

续表5Continue tab.5

2.5 AM 真菌组成的相似性系数

由表6可见，宁夏银川和沙坡头样地2012年和2013年均表现出较高相似性，说明2样地在AM 真菌种类组成上差异不显著；而甘肃民勤样地与其他样地相似性系数较低，表明民勤样地AM 真菌组成与其他样地差异显著.

表6 2012年和2013年不同样地AM 真菌组成的Sorensen相似性系数Tab.6 Sorensen index of AM fungi in different sampling sites and different years

2.6 土壤因子年际变化

由表7可知，3样地土壤理化性质在2年间均表现出浅表土层含量显著高于深层土.不同年份相比，相同土层在年际间含量存在差异.

表7 不同样地土壤因子年际变化Tab.7 Soil factors of different sampling sites and different years

续表7Continue tab.7

不同年份民勤样地：仅0～20cm 和30～40cm 土层脲酶2013年高于2012年；40～50cm 土层有机质2013年高于2012年，2012年30～40cm 土层含量高于2013年；40～50cm 土层总球囊霉素2012年高于2013年；不同土层易提取球囊霉素2013年均高于2012年；20～30cm 土层碱解氮2012年高于2013年；0～20cm 土层速效磷2013年高于2012年；40～50cm 土层速效钾2013年低于2012年；10～50cm 土层碱性磷酸酶2012年高于2013年，酸性磷酸酶无明显变化.

不同年份沙坡头样地：仅0～30cm 土层脲酶2013年高于2012年；40～50cm 土层有机质2013年高于2012年；总球囊霉素2013年高于2012年；0～40cm 土层易提取球囊霉素2013年高于2012年；0～30cm土层碱解氮2013年高于2012年，30～40cm 土层2012年高于2013年；30～50cm 土层速效磷2012年高于2013年；0～10cm 和30～50cm 土层速效钾2012年高于2013年；2012年碱性磷酸酶和酸性磷酸酶均高于2013年.

不同年份银川样地：仅0～20cm 土层脲酶2012年高于2013年，40～50cm 土层2013年高于2012年；40～50cm 土层有机质2013年高于2012年；总球囊霉素2013年均高于2012年；0～40cm 土层易提取球囊霉2013年高于2012年；10～20cm 和30～40cm 土层碱解氮2013年高于2012年；0～20cm 土层速效磷2013年高于2012年；40～50cm 土层速效钾2012年高于2013年；0～30cm 土层碱性磷酸酶2013年高于2012年；0～10cm 和20～40cm 土层酸性磷酸酶2013年高于2012年，10～20cm 和40～50cm 土层酸性磷酸酶2012年高于2013年.

2.7 AM 真菌物种多样性和土壤因子的关系

表8和图1对AM 真菌和土壤因子进行了相关性分析，结果表明，孢子密度与总球囊霉素、速效钾和酸性磷酸酶显著正相关；种丰度与脲酶、有机质、球囊霉素、碱解氮、速效磷和速效钾显著正相关.

表8 AM 真菌物种多样性与土壤因子相关性Tab.8 Correlation analysis between AM fungal species diversity and soil factors

图1 AM 真菌孢子密度和种丰度与土壤因子的RDA分析Fig.1 RDA analysis of AM fungal spore density，species richness and soil factors

2.8 土壤因子主成分分析

如表9所示，对土壤因子进行主成分筛选.根据相关矩阵特征值大于1，方差累计贡献率大于80%的原则，入选2个主成分.这2个主成分方差累积贡献率为85.423%.第1主成分中脲酶、有机质、碱解氮、速效磷、速效钾、碱性磷酸酶有较高载荷（权重在0.826～0.918），第2主成分中总提取球囊霉和酸性磷酸酶有较高载荷（权重在0.689～0.430），因第1主成分信息量大，故筛选出脲酶、有机质、碱解氮、速效磷、速效钾、碱性磷酸酶是主要影响因子.

表9 主成分载荷矩阵、特征值和贡献率Tab.9 Principle component loading matrix，eigenvalue and contribution rate

3 讨论

本研究分离鉴定的5属36种AM 真菌，高于钱伟华等［21］在毛乌素沙地分离出的28种，陈烝等［22］在柠条锦鸡儿根围分离的24种.结果表明，3个样地均表现出表层土AM 真菌孢子密度和种丰度相对较高，这与AM 真菌是好气性真菌有关，另外，浅表土层有较多枯枝落叶，有机质含量相对较高，这为AM 真菌生长提供了丰富的营养物质.AM 真菌物种多样性差异与宿主植物种类密切相关［23］，宿主植物及其根系特性是影响AM 真菌物种多样性的重要因素.蒙古沙冬青为多年生灌木，根系生长旺盛，常生长在沙质松软、土壤透气性好的沙丘中，这利于AM 真菌生长.本实验中，蒙古沙冬青AM 真菌物种多样性分布存在时空异质性，样地和土层间孢子密度和种丰度均存在差异，2年间，各样地AM 真菌种类略有变化，这可能是宿主植物及其根围土壤环境共同作用的结果.

氮、磷、钾是植物生长所需的主要营养元素，三大营养元素会以不同形式存在于土壤中，AM 真菌可将不利于直接吸收的部分转化为易于宿主植物吸收的形式［24］，这种转化在荒漠贫瘠土壤中尤为重要.本实验对影响AM 真菌多样性的土壤因子进行主成分分析，筛选出脲酶、有机质、碱解氮、速效磷、速效钾、碱性磷酸酶是主要影响因子.其中，脲酶可催化土壤中的尿素，增加植物根际氮源含量［25］，有利于AM 真菌和宿主植物利用和生长.磷酸酶可将土壤有机磷分解转化成易于植物根系吸收的无机磷，增加其生物有效性［26］.AM真菌能够分泌酸性磷酸酶活化有机磷，使得根围土壤P含量升高，从而为宿主植物根系提供更多易于吸收的P元素，AM 真菌与植物长期共生会有效改变土壤磷活性.通过AM 真菌多样性与土壤因子相关性分析表明，AM 真菌孢子密度与酸性磷酸酶显著正相关，种丰度与脲酶显著正相关.这一方面表明土壤酶会影响AM 真菌物种多样性，另一方面也表明AM 真菌通过土壤酶作用可有效改善土壤微环境.AM 真菌萌发的菌丝可将土壤营养物质转运给宿主植物利用，同样也可利用宿主植物合成的有机物质促进自身生长，使得AM 真菌与宿主植物处于良性循环过程中.

研究表明，年份不同会伴随宿主植物及其根围土壤因子的变化.本实验中，由于宿主植物生长以及当年的自然条件不同，导致2年相同月份3个样地土壤因子在不同土层均有变化，在土壤因子影响下，3个样地在2年间AM 真菌孢子密度、种丰度和真菌种类也出现了相应变化，这种对应关系与土壤因子会影响AM真菌种类和分布［27］研究结论相一致.有研究发现，蒙古沙冬青生长也会影响AM 真菌物种多样性变化［28］，植物生长年龄不同，所积累的营养物质以及根际生长状况不同，这可能也是导致AM 真菌出现差异的原因之一.

4 结论

本实验结果表明，宿主植物根围土壤理化性质直接影响着AM 真菌物种多样性.土壤深度会影响孢子密度，一般表层土孢子密度较高.该结论揭示了蒙古沙冬青与AM 真菌的共生关系，这为阐明蒙古沙冬青适应极端荒漠环境生长提供了依据，为利用菌根生物技术促进蒙古沙冬青生长奠定了基础.

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