张凤娟，曹佳培，王鹏，穆淑梅，康现江

（河北大学 生命科学学院，河北省动物系统学与应用重点实验室，河北 保定 071002）

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）蜕皮抑制激素（molt－inhibiting－hormone，MIH）属于甲壳动物高血糖激素家族（crustacean hyperglycemic hormone family）神经肽.该家族的激素包括：高血糖激素（crustacean hy－perglycemic hormone，CHH）、蜕皮抑制激素、性腺抑制激素（gonad－inhibiting hormone，GIH）、大颚器抑制激素（mandibular organ－inhibiting hormone，MOIH）.这些激素均包含6个半胱氨酸残基，形成3个链内二硫键.由于其结构相似，它们也具有交叉的生物学功能［1－4］.这些激素产生于眼柄的端髓X 器（medulla terminalis X－organ，MT－XO）或无眼柄甲壳类前脑相应的位置，释放到窦腺，进入血淋巴系统，参与调节甲壳类许多重要的生理过程［5－6］.

MIH 通过与蜕皮激素（ecdysone）相互作用调节甲壳动物蜕皮进程［7］.以前的研究认为MIH 只在甲壳动物的眼柄视上神经节的X 器官中表达，但是具体在眼柄视上神经节的哪几种分泌细胞中表达尚且未知［8－9］.据报道，X 器官中，小神经元细胞（直径15～25μm）产生促色素细胞激素，而大神经元细胞（直径30～70μm）产生高血糖家族激素［3，10］.近年来研究发现，MIH 不仅在X 器官中有分布，而且在甲壳动物的中枢神经系统（胸神经节、腹神经节和脑）中也存在，但与眼柄中的MIH 相比，可能在中枢神经系统中的MIH 发挥不同的作用［3，11］.

本实验利用分子生物学与免疫组织化学技术，对中华绒螯蟹MIH 进行系统的研究，并对其在视上神经节的分泌情况进行了具体的研究，可以为进一步研究其作用机制奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

实验用中华绒螯蟹购自河北省白洋淀；新西兰大白兔由河北大学实验中心提供；pET－30a载体（TaKa－Ra）、表达菌株大肠杆菌Rosseta（DE3）为本实验室保存.

1.2 方法

1.2.1 中华绒螯蟹MIH 蛋白的表达与纯化

按照姚燕等［12］的研究方法获得中华绒螯蟹的MIH 基因，并构建表达载体，构建好的表达载体命名为pET－30a－MIH.

将pET－30a－MIH 质粒导入大肠杆菌Rosseta（DE3）感受态细胞，37 ℃，200r／min振荡培养至OD600为0.6左右时，用0.5mmol／L IPTG 诱导表达4h，超声破碎后，离心收集沉淀，用8mol／L 的尿素溶解2h，12 000r／min 4 ℃离心20 min，取其上清液用镍柱进行纯化，纯化后的蛋白用体积分数为12%的SDSPAGE检测.

1.2.2 多克隆抗体的制备及特异性检测

按照常规方法制备兔抗多克隆抗体，在注射蛋白时，每次注射抗原2.0mg，间隔7～10d，注射4次；获得免疫血清.利用双向免疫扩散法检测抗体效价.用western blot法对血清的特异性进行检测，其中实验组以融合蛋白为抗原，以MIH 抗血清为一抗，而对照组以免疫前血清代替一抗，具体操作步骤按常规western blot法进行.

1.2.3 MIH 在视上神经节分布的免疫组织化学研究

解剖处于蜕皮间期的中华绒螯蟹眼柄置于布氏固定液（未加冰醋酸）中，4 ℃固定过夜，梯度脱水，常规石蜡包埋，进行连续切片，切片厚度为6μm，50 ℃烤片；常规脱蜡至水，用体积分数为3%的H2O2处理7～10min，以灭活内源性过氧化物酶.蒸馏水浸泡冲洗.用柠檬酸缓冲液（pH 6.0），采用微波修复法修复抗原.用质量分数为5%的BSA 室温孵育30min.一抗（MIH 抗血清）4 ℃过夜孵育，对照组用PBS代替一抗进行孵育.PBS浸洗3次，每次5min，在样品上滴加抗兔生物素化二抗，37 ℃孵育20min，PBS洗掉二抗.加上SABC 37 ℃孵育20min，PBS冲洗SABC.滴加DAB显色液，自来水冲洗，苏木精复染，梯度脱水至二甲苯，中性树胶封片.显微观察拍照.

2 结果

2.1 MIH 基因克隆结果

质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测结果在250bp处有特异性条带（图1），与预期大小（243bp）相符合.测序发现该片段与中华绒螯蟹蜕皮抑制激素成熟肽序列一致.

2.2 pET－30a－MIH 质粒双酶切鉴定结果

构建好的PET－30a－MIH 经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测在250bp处有目的条带（图2），表明表达载体构建成功且读码框正确.

图1 MIH 基因克隆结果Fig.1 Result of MIH cloning

图2 重组质粒PET－30a－MIH 双酶切电泳结果Fig.2 Enzyme digestion result of PET－30a－MIH recombinant plasmid

2.3 融合蛋白的表达与纯化

将带有pET－30a－MIH 质粒的表达菌株Rosseta（DE3）经诱导后用体积分数为12%的SDS－PAGE 电泳检测，在14.3ku与20.1ku之间有一特异条带（图3）.SDS－PAGE检测融合蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中，溶解后的包涵体蛋白用镍柱进行纯化，得到较高纯度的目的蛋白（图4）.

图3 融合蛋白在大肠杆菌中的表达Fig.3 Expression of fusion protein in E.coli

图4 融合蛋白镍柱纯化结果Fig.4 Purification of fusion protein using Ni－Resin

2.4 多克隆抗体效价及特异性的检测

多克隆抗体经双向免疫扩散测定其效价为1:32（图5）.用MIH 抗血清对融合蛋白进行免疫印迹分析，在14.3～20.1ku内有1特异条带，而对照组没有，表明其特异性较高（图6）.

图6 融合蛋白western blot结果Fig.6 Western blot result of the fusion protein

2.5 MIH 在视上神经节的免疫组织化学定位

康现江等［13］将中华绒螯蟹视上神经节分泌细胞分为5种类型，本实验发现端髓中的细胞类型1（ct）、细胞类型3（ct3）和细胞类型4（ct4）的核周围呈阳性反应，这表明ct1，ct3，ct4参与了MIH 的分泌（图7）.而阴性对照中均无阳性反应.

端髓中的ct1细胞核周围呈现阳性反应，由于MIH 在视上神经节中的合成和储存量很低，所以并不是所有的ct1细胞核周围均呈阳性反应（图7a）.ct3细胞核周围呈现阳性反应，由于切片方向不同，所以细胞核没有完全呈现，但是依据其位置和核大小确定其为ct3（图7a）.ct4周围呈阳性反应，故其也参与了MIH的分泌（图7c）.

图7 端髓中分泌MIH 的细胞免疫阳性反应（bar＝50μm）Fig.7 Immune positive reaction of cells in medulla terminalia

在中华绒螯蟹视上神经节的端髓与内髓交界处发现ct2细胞核周围呈现阳性反应（图8a），同时在窦腺（SG）处也呈现免疫阳性反应（图8c）.

图8 端髓与内髓交界及窦腺免疫阳性反应Fig.8 Immune positive reaction in SG and the edge of medulla terminalia

3 讨论

中华绒螯蟹视上神经节由外髓、内髓和端髓组成，神经分泌细胞主要集中分布在端髓，端髓在视神经节中体积最大，有大量神经分泌细胞分布.窦腺位于端髓与内髓交界偏端髓处，由神经分泌细胞轴突末端聚集而成，神经分泌细胞分泌的激素可暂时储存于此，之后排出运输至血液.中华绒螯蟹MIH 由眼柄视上神经节中的X－器官分泌，与蜕皮激素共同调节着中华绒螯蟹的蜕皮周期［14－18］.中华绒螯蟹MIH 基因成熟肽编码区含有228bp，编码75个氨基酸残基［19］，姚燕等［12］制备了中华绒螯蟹MIH 鼠抗抗体，并对抗体进行了效价的检测，但并未进行后续实验的研究.

康现江等［13］将中华绒螯蟹视上神经节分泌细胞分为5种类型，在本实验中，除细胞类型5之外，其他类型的细胞均具有阳性反应，证明细胞类型1、细胞类型2、细胞类型3和细胞类型4均参与了MIH 的分泌.MIH 在端髓细胞中分布，此结果与不同物种中MIH 的分泌位置的研究一致［20－21］.Gu等［22］研究发现，刀额新对虾（Metapenaeus ensis）中，MIH 在眼柄的分泌位置是端髓X－器官，但是，在其他中枢神经系统中，例如胸神经节、腹神经节中均无MIH 分泌.然而，在远海梭子蟹（Portunus pelagicus）中，MIH 不仅分布于眼柄中，在胸神经节、腹神经节等中枢神经系统中也有分布［3］.而在中华绒螯蟹中，除了眼柄以外的中枢神经系统是否分泌MIH 还不得而知，这也是今后的研究目标.在实验过程中发现，在没有细胞核分布的区域也有呈现阳性反应的，有可能是MIH 经这些分泌细胞的轴突或结缔组织被运往窦腺暂时储存或释放.此结果与Stewart等的研究结果相符［3］.

本实验研究了MIH 在眼柄中的分泌位置，为甲壳动物内分泌的研究提供新的资料，同时为解决虾蟹类的早熟问题提供参考.

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